Enhancing Phosphopeptide Quantitation using PREMIER Peptide CSH C18 Columns

Význam tématu

Analýza a kvantifikace fosfopeptidů je klíčová pro pochopení buněčného signálních drah a identifikaci cílů pro kinázové inhibitory. Fosforylace na reziduích serinu, threoninu a tyrosinu reguluje mnoho biologických dějů, ale přidání negativních skupin zvyšuje afinitu těchto molekul k metalickým povrchům a vede k jejich ztrátám během chromatografie. Technologie minimalizující interakce s kovem tak významně zlepšuje citlivost a reprodukovatelnost analýz.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává výkon konvenčních ACQUITY UPLC Peptide CSH C18 kolon s novou ACQUITY PREMIER Peptide CSH C18 kolonkou vybavenou MaxPeak High Performance Surface (HPS) technologií. Hlavním cílem bylo ověřit:

• recovery (obnovu) fosfopeptidů
• reprodukovatelnost a robustnost separací
• kvalitu MS signálu a výskyt kovových aduktů

Použitá metodika a instrumentace

Pro porovnání byly připraveny směsi nefosforylovaných (angiotensin I, enolase T37) a dvoufosforylovaného peptidu receptoru inzulínu. Analýzy probíhaly na systému ACQUITY PREMIER (QSM) s UV detekcí při 214 nm a na Xevo G2-XS QTof v ESI+ módu. Mobilní fáze: 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě (A) a 0,09 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu (B). Pracovní podmínky: teplota kolony 60 °C, průtok 0,2 mL/min, injekční objem 1 μL.
Pro kvantifikaci byly použity:

• MaxPeak HPS lahvičky (p/n 186009186)
• ACQUITY UPLC Peptide CSH C18, 1.7 μm, 2.1×50 mm (p/n 186002350)
• ACQUITY PREMIER Peptide CSH C18, 1.7 μm, 2.1×50 mm (p/n 186009452)
• Gemini XPS spektrofluorometr pro stanovení 5-FAM značeného peptidu

Hlavní výsledky a diskuse

1. Recovery fosfopeptidu:

• Konvenční kolony neobnovily téměř žádný dvoufosforylovaný peptid při prvních injekcích.
• PREMIER kolony dosáhly až 97,9% recovery i při první injekci a stabilních ~94 % při opakovaných bězích.

2. Reprodukovatelnost:

• PREMIER systém vykazoval změny ploch, kapacit a retencí < 3 % bez nutnosti předběžné kondice.
• Konvenční kolony po kondici stále nedosáhly srovnatelné obnovy.

3. Kvalita MS spekter:

• Konvenční kolony produkovaly významné množství železných aduktů (až 2× vyšší signál aduktů než hlavní iont).
• PREMIER technologie snížila výskyt kovových aduktů o 80–90 % a zvýšila relativní podíl nižšího nabití peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

PREMIER kolony s MaxPeak HPS povrchem:

• Usnadňují robustní a citlivou chromatografii fosfopeptidů bez rozsáhlé přípravy nebo přídavných chelátorů.
• Zlepšují kvantitativní přesnost a meze detekce bioanalytických metod pro proteomiku.
• Snižují interference kovových kontaminantů v MS detekci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření MaxPeak HPS technologií pro další bioanalytické aplikace a separaci dalších polárních či negativně nabitých molekul. Potenciál má zejména:

• skóre přijímání ve workflow pro proteomické platformy a farmakokinetické studie
• integrace do plně automatizovaných LC-MS systémů pro vysoce propustné screeningy
• další vývoj povrchových technologií pro eliminaci adsorpce kovů

Závěr

ACQUITY PREMIER Peptide CSH C18 kolony s MaxPeak HPS výrazně minimalizují ztráty fosfopeptidů na kovových plochách, zvyšují reprodukovatelnost a kvalitu MS dat. Technologie umožňuje téměř plnou obnovu i při prvním běhu bez předchozí kondice a značně redukuje kovové adukty, což vede k citlivějším a spolehlivějším bioanalytickým postupům.

Reference

1. Tuytten R. et al. Stainless-Steel Electrospray Probe: A Dead End for Phosphorylated Organic Compounds. J. Chromatogr. A. 2006;1104:209–221. doi:10.1016/j.chroma.2005.12.004.
2. Asara JM, Allison J. Enhanced Detection of Phosphopeptides in MALDI MS Using Ammonium Salts. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999;10:35–44. doi:10.1016/S1044-0305(98)00129-9.
3. Kjellstrom S, Jensen ON. Phosphoric Acid as a Matrix Additive for MALDI MS Analysis of Phosphopeptides. Anal. Chem. 2004;76:5109–5117. doi:10.1021/ac0400257.
4. Birdsall RE et al. Application of Mobile Phase Additives to Reduce Metal-Ion Mediated Adsorption. J. Chromatogr. B. 2019;1126–1127:121773. doi:10.1016/j.jchromb.2019.121773.
5. Lough J et al. Analyte Adsorption in LC Valve Injectors. J. Chromatogr. A. 1996;726:67–75.
6. Birdsall RE et al. Increasing Chromatographic Performance of Acidic Peptides…Waters Application Note, 2020.
7. DeLoffi M et al. Improved Chromatographic Performance with a PREMIER Peptide C18 Column…Application Brief, 2020.
8. Ji L et al. Quantitative MS Combined with Enrichment of Phosphopeptides…Anal. Chem. 2012;84:2284–2291. doi:10.1021/ac202897u.
9. Lauber M et al. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak HPS. Waters White Paper, 2020.
10. Cheng LC et al. Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-Free MS…J. Vis. Exp. 2018. doi:10.3791/57996.
11. McLachlin DT, Chait BT. Analysis of Phosphorylated Proteins and Peptides by MS. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001;5:591–602. doi:10.1016/S1367-5931(00)00250-7.
12. Smith KM et al. Sensitive and Reproducible RP-UHPLC Analysis of TCA Metabolites…Anal. Chem. 2020. doi:10.1021/acs.analchem.0c03863.
13. Lauber MA et al. High-Resolution Peptide Mapping Separations with Charge-Surface-Modified C18. Anal. Chem. 2013;85:6936–6944. doi:10.1021/ac401481z.
14. Vallée A et al. Peptide Interactions with Metal and Oxide Surfaces. Acc. Chem. Res. 2010;43:1297–1306. doi:10.1021/ar100017n.