Analysis of Plasma 17-Hydroxyprogesterone, Androstenedione, and Cortisol Using a Novel Solid-Phase Extraction (SPE) Sorbent, Oasis PRiME HLB, for UPLC-MS/MS Analysis in Clinical Research

Význam tématu

Analýza endogenních steroidů, jako jsou 17α-hydroxyprogesteron, androstenedion a kortisol, je v klinickém výzkumu klíčová pro diagnostiku endokrinních poruch a sledování terapie. Metoda UPLC-MS/MS poskytuje vysokou selektivitu a multiplexní schopnosti oproti konvenčním imunodiagnostikám, které často trpí křížovou reaktivitou.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat rychlý a spolehlivý postup přípravy plazmatických vzorků pro simultánní kvantifikaci tří steroidů. Autoři představují použití nového SPE sorbentu Oasis PRiME HLB v µElution formátu pro odstranění fosfolipidů a následnou analýzu pomocí UPLC-MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Proteinová precipitace plazmy roztokem 4:1 MeOH / 89 g/L ZnSO₄.
• Acidifikace supernatantu 4 % H₃PO₄, aplikace na Oasis PRiME HLB µElution 96-well destičku.
• Proplach 2×200 µL 25 % methanolu, eluce 2×25 µL 90:10 ACN:MeOH.

UPLC podmínky:

• ACQUITY UPLC I-Class se sloupcem HSS T3 (2,1×50 mm, 1,8 µm), teplota kolony 40 °C.
• Gradient mobilní fáze voda/ACN s 0,1 % formiátu, průtok 0,6 mL/min, doba analýzy 4,5 min.

MS/MS podmínky:

• Xevo TQ-S, pozitivní ESI, MRM režim dvou tranzic na analyty.
• Optimalizované kapilární napětí, teploty (150–500 °C) a plynné toky.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie všech tří sloučenin proběhla pod 2 minuty s dobrým rozlišením a stabilním návratem retence na T3 sloupci. Průměrné extrakční výtěžky dosáhly 71–73 % (RSD<5 %) a matrikové efekty byly minimální (–19 % pro kortisol, <10 % pro ostatní). Kalibrační křivky vykazovaly lineární odezvu (R² ≥ 0,99) v rozsazích 1–500 ng/mL pro kortisol a 0,05–25 ng/mL pro ostatní. LLOQ dosáhly 1,0 ng/mL pro kortisol a 0,05 ng/mL pro androstenedion a 17-OHP. QC vzorky měly přesnost v rámci ±10 % a precizi <7 % CV.
Odstranění fosfolipidů překročilo 97 % (reálně až 99 % při zohlednění koncentračního faktoru), což výrazně snižuje zanášení kolony a fouling zdroje.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácená a zjednodušená příprava bez kondicionování SPE sorbentu.
• Eliminace nutnosti odpařování a rekonstituce ekstraktu.
• Vysoká reprodukovatelnost, stabilita metody a nízké matrikové interferencí.
• Možnost simultánního stanovení více steroidů v klinických vzorcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

S využitím µElution formátu a nových sorbentů lze očekávat další zrychlení workflow a automatizaci přípravy vzorků. Zároveň pokračující vývoj selektivních sorbentů a kolonnových chemistrií přispěje k rozšíření multiplexních panelů steroidů a dalších biomarkerů v klinické a farmakokinetické praxi.

Závěr

Použití Oasis PRiME HLB µElution destičky v kombinaci s UPLC-MS/MS poskytuje rychlý, robustní a vysoce selektivní postup pro stanovení 17-OHP, androstenedionu a kortisolu v plazmě. Metoda zajišťuje vynikající čistotu extraktu, nízké matrikové efekty a splňuje přísné požadavky na validaci bioanalytických metod.

Reference

• Bansal S., DeStefano A.: Key elements of bioanalytical method validation for small molecules. The AAPS Journal 9(1): E109–E114 (2007).
• Chambers E., Wagrowski-Diehl D.M., Lu Z., Mazzeo J.R.: Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses. Journal of Chromatography B 852(1–2): 22–34 (2007).
• Xia Y.-Q., Jemal M.: Phospholipids in liquid chromatography/mass spectrometry bioanalysis: comparison of three tandem mass spectrometric techniques for monitoring plasma phospholipids, the effect of mobile phase composition on phospholipids elution and the association of phospholipids with matrix effects. Rapid Communications in Mass Spectrometry 23(14): 2125–2138 (2009).