Bile Acid Profiling Using UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC2) Coupled to ESI-MS/MS

Význam tématu

Žlučové kyseliny hrají ústřední roli jako signální molekuly regulující transport triglyceridů, cholesterolu a glukózy. Jejich hladiny v biologických vzorcích odrážejí stav jaterních funkcí a metabolických procesů, proto je přesné a rychlé stanovení profilu žlučových kyselin zásadní pro výzkum metabolických onemocnění, klinickou diagnostiku a vývoj nových léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat metodiku založenou na UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC2) v kombinaci s ESI-MS/MS pro simultánní profilování a kvantifikaci 25 žlučových kyselin včetně jejich glycinových a taurine konjugátů během jediné 13minutové analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika využívá mobilní fázi na bázi superkritického CO₂ s modifikátorem (ethanol s přísadami upravujícími pH), který umožňuje vyšší difuzi analytů a nižší zpětný tlak. Separace probíhá na ACQUITY UPC2 systému se sub-2 µm částicovým kolonou a detekce je zajištěna na Xevo TQ-S hmotnostním spektrometru v ESI negativním režimu bez make-up flow.

Pro přípravu vzorku bylo použito deproteinování potkaního séra metanolem v poměru 3:1 (metanol/se­rum), následné odstředění a aplikace supernatantu na UPC2/MS/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo dosaženo rozlišení a kvantifikace všech 25 cílových žlučových kyselin včetně konjugovaných forem během 13 minut, což představuje zhruba dvojnásobné zkrácení času oproti klasickému LC-MS. Metoda vykázala reprodukovatelné hodnoty retence i kvantifikace (n=6) při zachování dostatečného rozlišení isomerů. Aplikace na vzorky potkaního séra ukázala spolehlivou detekci koncentrací v rozsahu pg/µl.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy žlučových kyselin na polovinu ve srovnání s konvenční LC
• Simultánní detekce konjugovaných a nekonjugovaných forem bez komplikovaných derivatizačních kroků
• Vysoká citlivost a specifičnost v ESI negativním režimu
• Uplatnění v klinické diagnostice, farmakologickém výzkumu a vyšetřování patofyziologie metabolických onemocnění

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda UPC2-MS/MS se může dále rozvíjet v následujících směrech:

• Rozšíření panelu analyzovaných metabolitů včetně steroidů a lipidů
• Automatizace přípravy vzorků a integrace vysokopropustných pracovních postupů
• Využití v personalizované medicíně pro monitorování léčebných režimů
• Propojení s dalšími omickými technologiemi pro komplexní biologické studie

Závěr

UltraPerformance Convergence Chromatography ve spojení s ESI-MS/MS představuje efektivní a rychlou metodu profilování žlučových kyselin. Díky vysoké citlivosti, schopnosti rozlišit izomery a značnému zkrácení doby analýzy je tato technika perspektivní pro široké uplatnění v biomedicínském výzkumu a farmaceutickém průmyslu.

Reference

1. Houten SM, Watanabe M, Auwerx J. Endocrine functions of bile acids. The EMBO Journal. 2006;25(7):1419–1425.
2. Barnes S, Gallo GA, Trash DB, Morris JS. Diagnostic value of serum bile acid estimations in liver disease. Journal of Clinical Pathology. 1975;506–509.
3. Qiao X, Ye M, Xiang C, Bo T, Yang W, Liu C, Miao W, Guo D. Metabolic regulatory effects of licorice: a bile acid metabonomic study by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Steroids. 2012;77(7):745–755.
4. Patti ME et al. Serum bile acids are higher in humans with prior gastric bypass: potential contribution to improved glucose and lipid metabolism. Obesity (Silver Spring). 2009;17(9):1671–1677.
5. Ye L, Liu S, Wang M, Shao Y, Ding M. High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of bile acid profiles in serum of women with intrahepatic cholestasis of pregnancy. Journal of Chromatography B. 2007;860(1):10–17.