Establishment of a Robust mAb Subunit Product Quality Attribute Monitoring Method Suitable for Development, Process Monitoring, and QC Release

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) patří mezi klíčové bioterapeutika, kde přesné sledování kritických kvality atributů (CQA) zajišťuje bezpečnost a účinnost produktu.
Subunit MAM (multi-attribute method) přináší rychlejší přípravu vzorku, kratší dobu analýzy a méně artefaktů než klasické peptidové mapování, čímž podporuje rychlejší vývoj, monitoring výroby i kontrolu uvolňovaných šarží.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje robustní subunitní MAM metodu aplikovanou na LC-MS platformách BioAccord a Vion IMS QTof s cílem:

• monitorovat glykosylaci, glykaci, oxidaci a sekvenční varianty mAb
• ověřit reprodukovatelnost a přesnost na několika systémech a kolónách
• ukázat využitelnost pro vývoj, procesní monitoring a QC uvolňování

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky mAb byly štěpeny IdeS enzymem a částečně redukovány DTT pro uvolnění LC, Fd a Fc subjednotek (~25 kDa). Následovala RP-UPLC separace na kolóně Waters ACQUITY BEH C4 (2.1×50 mm, 1.7 µm) při 80 °C a detekce na ACQUITY UPLC TUV.
LC-MS podmínky:

• UPLC systémy: ACQUITY UPLC I-Class, BioAccord a Vion IMS QTof
• Mobilní fáze: 0.1 % kyselina máselná ve vodě a acetonitrilu, tok 0.25 mL/min, gradient 15 min
• MS: TOF detektor, dekonvoluce MaxEnt1, data management UNIFI v1.9.4 a waters_connect

Hlavní výsledky a diskuse

1) Robustnost: triplikáty trastuzumabu na třech kolónách měly RSD glyckace LC 8 %, Fc glykosylace < 5 % pro všechny formy > 0.5 % abundanční.
2) Case study – glykoprofiling cetuximabu: lokalizace N-glykanů v Fd i Fc bez nutnosti frakcionace; RSD glykozylace < 3 %.
3) Case study – sekvenční varianty: mix originátoru a mutovaného trastuzumabu (V104L, E359D, M361L) v rozsahu 0.5–50 %, lineární kvantifikace (R2=0.9994).
4) Case study – forced oxidation: NIST mAb vystaven H2O2 ukázal selektivní oxidaci Fc subjednotky s přechodem na +1 a +2 oxyformy.
Diskuse upozorňuje na limity metody při rozdílení izobarních modifikací (deamidace, izomerizace) a nemožnost lokalizace více modifikací v rámci jedné subjednotky bez peptidového mapování.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlená příprava vzorku a zvýšená propustnost laboratoře
• Snížení metodou indukovaných artefaktů oproti peptidovému mapování
• Souběžné sledování glykosylace, glykace, oxidace a sekvenčních variant v jedné analýze
• Kompatibilita s regulovanými prostředími díky platformám UNIFI a waters_connect

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrované on-line monitorování procesu s automatizovanou přípravou a interpretací dat
• Rozšíření na další bioterapeutika (Fc-fusion proteiny, bispecifické protilátky)
• Hybridní strategie kombinující subunit MAM s vysokorozlišeným peptidovým mapováním pro komplexní CQA profiling
• Využití iontové mobility pro zlepšené rozlišení izobarních forem

Závěr

Subunitní MAM metoda poskytuje rychlý, robustní a reprodukovatelný přístup ke komplexnímu sledování kvality mAb produktů. Platformy BioAccord a Vion IMS QTof spolu s UNIFI/waters_connect nabízejí compliance-ready řešení vhodné pro vývoj, výrobní monitoring a QC uvolňování bioterapeutik.

Reference

1. Dong J. et al. Anal Chem. 2016;88:8673–8679.
2. Sokolowska I. et al. mAbs. 2017;9(3):498–505.
3. Sokolowska I. et al. Anal Chem. 2020;92:2369–2373.
4. Glycoworks RapiFluor MS N-glycan kit Care and Use Manual. Waters.
5. Shion H. et al. Application Note 720006472en. Waters 2019.
6. Giddens J. et al. PNAS. 2018;115(47):12023–12027.
7. Ayoub D. et al. mAbs. 2013;5(5):699–710.
8. Lin T. et al. mAbs. 2019;11(1):1–12.