Improved Analytical Sensitivity and Chromatographic Peak Shape for the Quantification of TCA Cycle Analytes in Human Plasma using the ACQUITY PREMIER System Solution

Význam tématu

Podrobná analýza metabolitů trikarboxylového cyklu (TCA) v lidské plazmě umožňuje pochopit energetické a regulační procesy v buňkách, podporuje vývoj biomarkerů pro onemocnění a zlepšuje klinickou diagnostiku. Malé, polarizované sloučeniny jsou však náchylné ke kontaktu s kovovými povrchy, což snižuje citlivost a ovlivňuje tvary chromatografických špiček.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout rychlou a citlivou metodu pro kvantifikaci organických kyselin TCA cyklu v lidské plazmě s jednoduchou mobilní fází, minimalizovat dodatečné úpravy mobile faze a eliminovat interakce kov–analyty.

Použitá metodika

Proteinová precipitace s metanolem, vysoušení a rekonstituce vzorků v vodu. Chromatografická separace je založena na smíšeném aniontově donor-ace chromatografickém módu s jednoduchou mobilní fází 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a v acetonitrilu. Kvantifikace probíhá metodou tandemové hmotnostní spektrometrie (MRM) v negativním ionizačním módu s použitím stabilně značených vnitřních standardů.

Použitá instrumentace

• UPLC ACQUITY PREMIER System
• Kolona ACQUITY PREMIER CSH Phenyl-Hexyl 2.1×100 mm, 1.7 μm
• Mass spectrometer Xevo TQ-S micro
• Softwarové balíčky MassLynx v4.2 a TargetLynx
• Deaktivované vialy Waters Total Recovery

Hlavní výsledky a diskuse

• MaxPeak HPS technologie významně zvýšila plošné velikosti špiček: isocitrát +41×, citrát +5×, 3-fosfoglycerát >100×.
• Malát vykázal snížení špičkového roztažení (tailing) o 58 %.
• Analytická citlivost byla stabilní již od první injekce na novém systému (>100× u citrátu), což odráží minimální potřebu stabilizace aparatury.
• Kalibrace pro koncentrace 0,033–167 μM byla lineární s vážením 1/x, výsledné hodnoty v plazmě odpovídaly očekávaným koncentracím u zdravých i onkologických vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé použití jednoduché mobilní fáze bez komplexních modifikátorů.
• Vysoká citlivost a ostrý tvar špiček umožňují přesnou a spolehlivou kvantifikaci.
• Rychlá příprava vzorku a kratší doba analýzy zvyšují propustnost laboratoře.
• Metoda je vhodná pro výzkum, klinickou analýzu a QA/QC v průmyslové a farmaceutické praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektra analyzovaných metabolitů a aplikace ve více typech biologických matric.
• Integrace s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie pro objev neznámých biomarkerů.
• Automatizace přípravy vzorků a datové zpracování pro zvýšení efektivity.
• Využití v klinickém prostředí pro monitorování metabolických onemocnění a personalizovanou medicínu.

Závěr

Metoda založená na ACQUITY PREMIER System a MaxPeak HPS technologii nabízí robustní řešení pro kvantifikaci TCA cyklu a souvisejících metabolitů v lidské plazmě bez nutnosti použití silných přísad v mobilní fázi. Výsledkem je zkrácená doba analýzy, vynikající citlivost a reprodukovatelnost, což podporuje širší využití v analytické a klinické praxi.

Reference

1. Murray RK, Bender DA et al. Harper's Illustrated Biochemistry, 28th ed., McGraw-Hill, 2009.
2. Martínez-Reyes I, Chandel NS. Mitochondrial TCA Cycle Metabolites Control Physiology and Disease. Nat Commun, 2020;11:1.
3. Siegel D et al. Challenges in Analysis of Central Carbon Metabolites by LC-MS. J Chromatogr B, 2014;966:21–33.
4. Gil A et al. Stability of Energy Metabolites in Metabolomics. Electrophoresis, 2015;36(18):2156–2169.
5. Abrahamson HB et al. Studies of Iron(III) Complexes with Citric Acid. Inorg Chim Acta, 1994;226:117–127.
6. Sakamaki H et al. Evaluation of Column Hardware for Phosphorylated Compounds. J Chromatogr A, 2015;1381:125–131.
7. Roberts D, Ruane R, Wilson I. Picolinic Acid as Mobile Phase Additive. J Chromatogr, 1989;471:437–441.
8. Hsiao JJ et al. Improved LC-MS Methods for Metal-Sensitive Analytes. Anal Chem, 2018;90(15):9457–9464.
9. Myint K et al. Polar Anionic Metabolome Analysis by Nano-LC-MS. Anal Chem, 2009;81:7766–7772.
10. Lauber M et al. Low Adsorption UPLC Columns with MaxPeak HPS; Waters White Paper, 2020.
11. Smith KM, Plumb R, Rainville PD. Separation of TCA Cycle Metabolites and Related Compounds in Human Urine by UPLC-MS/MS. Waters Technology Brief, 2019.
12. Waters Corporation. Featured Products: ACQUITY PREMIER, Xevo TQ-S micro, MassLynx, TargetLynx.