A Center of Excellence for Precision Medicine

Význam tématu

Oxidační stres je spojen s rozvojem řady onemocnění včetně kardiovaskulárních chorob, diabetu či neurodegenerativních stavů. Kvantifikace lipidové peroxidace pomocí F2-isoprostanstinů představuje zlatý standard pro hodnocení systémového oxidačního poškození. Vysoce citlivé a specifické testy jsou klíčové pro výzkum patofyziologie i pro klinická rozhodnutí, například v diagnostice akutního infarktu myokardu či monitorování účinnosti terapeutických zásahů.

Cíle a přehled studie

Cílem projektu vedeného Dr. Chesterem Drumem bylo vyvinout spolehlivou, rychlou a vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro měření F2-isoprostanu F2α v lidské plazmě a moči. Studie se realizovala ve spolupráci Národního univerzitního zdravotního systému v Singapuru a společnosti Waters, která poskytla nejmodernější nástroje a aplikační podporu. Projekt zahrnoval optimalizaci vzorové přípravy, validaci extrakčního protokolu a porovnání výkonnosti nové aparatury s konvenčními systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace a chemie:

• LC-MS/MS přístrojová sestava Waters: Xevo TQ-XS tandemuální kvadrupólový hmotový spektrometr spojený s ACQUITY UPLC I-Class systémem
• SPE příprava vzorku s Oasis MAX mikroelucí pro selektivní izolaci F2-isoprostanu

Klíčové kroky metodiky:

• Nativní vzorek plazmy (20–50 µl) je aplikován na kolonu Oasis MAX
• Omytí sorbentu, následná mikroeluce v objemu vhodném pro přímou LC-MS/MS analýzu
• Elutát bez nutnosti dalšího sušení či rekonstituce
• Kvantifikace na základě interního standardu s vyhodnocením měrné citlivosti (LLOQ ~50 pg/ml)

Hlavní výsledky a diskuse

Po nasazení Xevo TQ-XS přístroje se dosáhlo následujících zlepšení oproti stávající kvadrupólové LC-MS/MS technologii:

• Snížení limitu kvantifikace z řádu 200 pg/ml na 50 pg/ml
• Možnost práce s malým objemem vzorku (20 µl vs. min. 100 µl dříve)
• Výrazně lepší rozlišení a poměr signál/šum při analýze 8-isoprostanu

Při prvních pilotních měřeních na souborech bariatrických pacientů byly prokázány statisticky významné změny koncentrací F2-isoprostanu po operačním úbytku hmotnosti, korelující s klinickou redukcí oxidačního stresu a zlepšením metabolických parametrů.

Přínosy a praktické využití metody

Nová LC-MS/MS metoda přináší:

• Vysokou specificitu a selektivitu pro F2-isoprostany bez potřeby derivatizace
• Vysokou propustnost a rychlou přípravu s možností automatizace
• Minimalizaci objemu biologického materiálu
• Široké možnosti nasazení v klinických studiích, farmaceutickém vývoji i biobankách

Budoucí trendy a možnosti využití

Projekt směřuje k rozsáhlé validaci na retrospektivních souborech (>1 200 pacientů) s dlouhodobými mortalitními výsledky. Možné další směry rozvoje:

• Intervenční studie titrující terapii podle hodnot F2-isoprostanu
• Integrace s bioinformatickými nástroji pro fenotypizaci pacientů
• Rozšíření spektra sledovaných biomarkerů oxidační stressu a zánětu
• Komercializace testu pro rutinní klinické laboratoře

Závěr

Spolupráce mezi NUHS a Waters umožnila rychlý vývoj a validaci vysoce citlivé LC-MS/MS metody pro kvantifikaci F2-isoprostanu, která překonává limitace dřívějších přístupů. Řešení založené na Xevo TQ-XS nabízí jedinečnou kombinaci citlivosti a efektivity při malém objemu vzorku, což otevírá nové možnosti pro výzkum i klinickou praxi v oblasti oxidačního stresu.