Charge Variant Analysis of Infliximab on the Alliance, ACQUITY Arc Bio, and ACQUITY UPLC H-Class Bio Liquid Chromatography Systems Using a Quaternary pH Gradient

Význam tématu

Ion exchange chromatografie je klíčovou technikou pro analýzu nabitých variant proteinů, zejména terapeutických monoklonálních protilátek. Separace na základě rozdílů v pH a salinitě umožňuje potvrdit konzistenci produktu a detekovat posttranslační modifikace ovlivňující biologickou aktivitu a bezpečnost léčiva.

Cíle a přehled studie

Tato studie porovnává schopnost tří chromatografických systémů – Alliance, ACQUITY Arc Bio a ACQUITY UPLC H-Class Bio – generovat kvaternární pH gradient pomocí funkce Auto•Blend Plus pro reprodukovatelné oddělení lysinových nábojových variant protilátky infliximab.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografické systémy: Alliance HPLC, ACQUITY Arc Bio, ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Funkce Auto•Blend Plus v softwaru Empower pro přípravu gradientu ze čtyř koncentrátů (kyselina, báze, sůl, voda)
• Kolona Protein-Pak Hi Res SP (4,6 × 100 mm, 7 μm), teplota 25 °C, vzorek držen při 4 °C
• Mobilní fáze: A – 100 mM MES, B – 100 mM Na₂HPO₄, C – 1 M NaCl, D – voda
• Podmínky: průtok 0,5 mL/min, gradient pH 5,5→7,2 a solný gradient 40→500 mM
• Vzorek: 4 mg/mL infliximab, injekce 3 µL, detekce TUV 280 nm

Hlavní výsledky a diskuse

• Na každém systému bylo provedeno pět injekcí, všechny tři systémy vykázaly stabilní chromatografické profily.
• ACQUITY Arc Bio dosáhl nejnižších standardních odchylek retenčních časů (0,003–0,007 min) oproti systémům Alliance (0,019–0,019 min) a UPLC H-Class Bio (0,026–0,037 min).
• Relativní plochy lyzinových variant Lys+0, Lys+1 a Lys+2 byly na všech systémech srovnatelné (cca 45 %, 25 % a 29 %).
• Výsledky dokazují vysokou robustnost metody a přenositelnost mezi různými LC platformami.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a reprodukovatelná analýza nábojových variant monoklonálních protilátek.
• Snadný přenos metody mezi laboratořemi a přístroji s minimální nutností úprav.
• Podpora kvality a kontrolních procesů při vývoji a výrobě bioléčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní identifikaci posttranslačních modifikací.
• Rozšíření aplikace na různé třídy bílkovin a dalších biologických produktů.
• Automatizace a paralelizace analýz pro zvýšení kapacity laboratoře.
• Využití umělé inteligence pro pokročilou interpretaci chromatografických dat.

Závěr

Metoda kvaternárního pH gradientu generovaného funkcí Auto•Blend Plus prokázala vysokou reprodukovatelnost a robustnost při analýze nábojových variant infliximabu na třech testovaných chromatografických systémech. Nejlepší precision pro retence poskytl systém ACQUITY Arc Bio, přičemž kvantifikace variant zůstala konzistentní napříč platformami.

Reference

• Reed C.E., Koza S.M., Chen W. Charge Variant Analysis of Infliximab on the Alliance, ACQUITY Arc Bio and ACQUITY UPLC H-Class Bio Systems Using a Quaternary pH Gradient. Technology Brief, Waters Corporation 2018.
• Waters Application Note 720004906EN. Charge Variant Analysis of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using a pH Gradient Generated by Auto•Blend Plus 2018.