Synthetic Peptide Impurity Analysis on Waters Reversed-Phase Columns

Význam tématu

Reverzní fáze chromatografie je zásadní pro analýzu nečistot v syntetických peptidových terapeutikách, protože umožňuje odlišit i malé modifikace peptidů jako deamidace, oxidace, inserce či fragmenty.
Peptidy představují rostoucí třídu bioterapeutik a čistota finálního produktu přímo ovlivňuje jeho bezpečnost a účinnost.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo systematicky porovnat výkonnost vybraných Waters kolonn reverzní fáze pro separaci řady komerčně dostupných syntetických peptidů a jejich nečistot.
Analýza proběhla při generických gradientních podmínkách se třemi typy mobilních fází (0,1 % formiová kyselina, 0,1 % trifluoroctová kyselina, 20 mM amonná forma pH 10).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lyofilizovaných peptidů z Bachem byly rekonstituovány ve vodě a zředěny v 0,1 % formiové kyselině.
Chromatografie se prováděla na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio se sloupky:

• Peptide BEH C18, 130Å a 300Å
• Peptide CSH C18, 130Å
• Peptide HSS T3, 100Å
• CSH Phenyl-Hexyl, 130Å
• CSH Fluoro-Phenyl, 130Å
• BEH C8, 130Å

Detekce byla zajištěna UV detektorem UPLC TUV (214 nm) a data se vyhodnocovala v softwaru MassLynx v4.1.

Hlavní výsledky a diskuse

Neexistuje univerzální kolon, který by vyhovoval všem testovaným peptidům. Zásadní rozdíly se projevily v třech aspektech:

• Selectivita: Chemie stacionární fáze a typ mobilní fáze (pH, iontové pár) zásadně ovlivňují rozlišení nečistot jako deamidace, aspartimidace, inserce či deletce.
• Retentivita: Sloupky CSH poskytují nejnižší retenci, HSS T3 nejvyšší, BEH C18 300Å vyšší retenci pro větší peptidy (>2100 Da).
• Kapacita naložení a šířka piku: Sloupky CSH vykazují nejvyšší kapacitu a nejmenší šířku piku, vhodné pro detekci stopových nečistot.

Během screeningu byly identifikovány různé typy nečistot: fragmenty peptidů, inserce aminokyselin, oxidace methioninů, isomery vytvořené aspartimidací, sulfonace a acetylace.

Přínosy a praktické využití metody

Systematické screenování několika reverzních fází ušetří čas při hledání optimálních podmínek pro rutinní QA/QC syntetických peptidů.
Doporučené čtyři peptide-optimalizované kolony (BEH C18 130Å/300Å, CSH C18 130Å, HSS T3 100Å) poskytují opakovatelné výsledky a široké pokrytí selektivit.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj nových ligandů a částic, jako jsou CORTECS C18+, CORTECS T3, směřuje k lepšímu rozlišení polárních a krátkých peptidů.
Integrace s pokročilou LC-MS/MS a automatizace workflow zvýší citlivost a průchodnost analýz.
Možné využití ve vývoji bioterapeutik, high-throughput screening a monitoringu stability peptidů.

Závěr

Studie potvrdila, že screening více reverzních fází je klíčový pro komplexní identifikaci a kvantifikaci nečistot syntetických peptidů.
Pro většinu aplikací je vhodné nejprve otestovat čtyři specializované peptide-kolony Waters a poté dle potřeby doplnit další chemie.

Reference

1. Ali R. et al. New peptide based therapeutics approaches. Omics Group eBooks, 2014.
2. Vliehe P. et al. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug Discovery Today. 2010;15(1-2).
3. Merrifield RB. Solid phase peptide synthesis. J Am Chem Soc. 1963;85(14):2149–2154.
4. Eggen I. et al. Control strategies for synthetic therapeutic peptide APIs Part III. Pharm Technol. 2014;38(5).
5. Bracke N. et al. Related impurities in peptide medicines. J Pharm Biomed Anal. 2014;101:2–30.
6. Koza S., Chambers EE. Selecting a reversed-phase column for peptide mapping. Waters Application Note. 2017.
7. Wikipedia: Bivalirudin.
8. Mayo Clinic: Bivalirudin description.
9. DrugBank: Ceruletide.
10. Wikipedia: Desmopressin.
11. Wikipedia: Lanreotide.
12. DrugBank: Secretin.
13. Toney K. et al. Aspartimide formation in pro-opiomelanocortin. J Biol Chem. 1993;268(2):1024–1031.
14. RxList: Calcitonin salmon.
15. GenScript: Parathyroid hormone fragment.