Purifikace proteinů je klíčovým krokem v biofarmaceutickém výzkumu, proteomice a průmyslové biotechnologii. Spočívá v izolaci konkrétního proteinu ze složitých biologických směsí při zachování jeho nativní struktury a aktivity. Tradičním metodám, jako je srážení nebo dialýza, chybí přesnost potřebná pro izolaci proteinů s vysokou čistotou, zejména pokud se jedná o terapeutické cíle nebo složité proteinové komplexy.Purifikace proteinů pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC) tuto oblast zásadně proměnila, protože nabízí vysoké rozlišení, reprodukovatelnost a rychlost, díky čemuž je nepostradatelná jak pro analytické, tak pro preparativní pracovní postupy.<h3>Co je purifikace proteinů pomocí HPLC?</h3>Purifikace pomocí HPLC využívá selektivních interakcí mezi proteiny a stacionární fází při průchodu mobilní fáze kolonou pod vysokým tlakem. Separace je založena na rozdílech ve velikosti, náboji, hydrofobnosti nebo afinitě proteinů ke stacionární fázi.Na rozdíl od konvenčních nízkotlakých metod, jako je gelová filtrace nebo afinitní purifikace, probíhá purifikace pomocí HPLC pod vysokým tlakem (až 6000 psi), což umožňuje rychlejší separaci s vyšším rozlišením a kvantitativní výtěžností. HPLC navíc umožňuje přesnou kontrolu parametrů, jako je složení gradientu, pH a teplota, čímž minimalizuje variabilitu mezi jednotlivými běhy.Na rozdíl od tradiční kolonové chromatografie používá HPLC menší částice stacionární fáze (3–10 µm), což vede ke zvětšení povrchové plochy a ostřejším <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/resources/knowledge-center/hplc-knowledge-center/how-to-reduce-peak-tailing-in-hplc">tvarům píků</a>, které jsou zásadní pro hodnocení čistoty proteinů a škálování procesu purifikace.<h3>Typy HPLC používané pro purifikaci proteinů</h3>V závislosti na fyzikálně-chemických vlastnostech cílového proteinu lze použít různé režimy HPLC. Každá metoda nabízí jedinečné výhody z hlediska selektivity a výtěžnosti.<h4>HPLC s reverzní fází (RP-HPLC)</h4><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/techniques/hplc-reversed-phase">HPLC s reverzní fází</a> separuje proteiny na základě hydrofobních interakcí mezi analytem a stacionární fází, typicky na kolonách se stacionární fází C4, C8 nebo C18 na bázi silikagelu. Proteiny se eluují pomocí gradientů organických rozpouštědel (obvykle acetonitrilu nebo methanolu) v přítomnosti těkavých kyselin, jako je kyselina mravenčí nebo trifluoroctová (TFA).Tato metoda poskytuje výjimečné rozlišení a běžně se používá k purifikaci proteinových fragmentů a analýze rekombinantních proteinů. Například HPLC s reverzní fází se rutinně využívá při přípravě peptidových léčiv, například při procesu <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/an59280424_w_fc6c3ac6f0.pdf">přípravy a purifikace tirzepatidu</a>, kde jsou čistota a výtěžnost rozhodující pro účinnost léčiva. Vzhledem k použití organických rozpouštědel však může RP-HPLC způsobit částečnou denaturaci, což omezuje její využití při purifikaci nativních proteinů.<h4>Iontově výměnná HPLC (IEX-HPLC)</h4><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/techniques/hplc-sec">IEX-HPLC</a> separuje proteiny na základě jejich čistého povrchového náboje. Kationtová výměna (s negativně nabitou stacionární fází) váže kladně nabité proteiny, zatímco aniontová výměna funguje opačně.Postupným zvyšováním koncentrace soli nebo změnou pH mobilní fáze se proteiny eluují podle svých izoelektrických bodů (pI).Tento přístup je velmi vhodný pro purifikaci nativních proteinů, analýzu proteinových izoforem a charakterizaci nábojových variant, což jsou zásadní kroky při výrobě terapeutických proteinů.<h4>Velikostně-vylučovací chromatografie (SEC-HPLC)</h4>SEC separuje molekuly na základě jejich hydrodynamického poloměru. Větší proteiny se eluují jako první, protože jsou vyloučeny z pórů stacionární fáze, zatímco menší molekuly do nich pronikají a eluují se později.<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.phenomenex.com/techniques/hplc-sec">SEC-HPLC</a> je nedenaturační metoda, která je ideální pro stanovení molekulové hmotnosti proteinů, jejich oligomerního stavu a obsahu agregátů. Často se používá jako závěrečný purifikační krok po iontoměničové nebo afinitní chromatografii.<h4>Afinitní HPLC</h4>Afinitní HPLC využívá specifické biologické interakce mezi cílovým proteinem a ligandem imobilizovaným na stacionární fázi (např. protilátkami, kovovými ionty nebo tagy, jako jsou His-tag nebo GST).Při použití v systému HPLC poskytuje afinitní chromatografie vysokou selektivitu a čistotu (&gt;95 %) v jediném kroku. Často se využívá při purifikaci rekombinantních proteinů a v aplikacích zaměřených na zachycení biomarkerů.<h3>Výhody použití HPLC pro purifikaci proteinů</h3>Purifikace proteinů pomocí HPLC kombinuje analytickou přesnost chromatografie s preparativními možnostmi potřebnými pro výzkum i biovýrobu. Mezi hlavní benefity patří:<h5>Výhoda &nbsp;/ &nbsp;Popis</h5>Vysoké rozlišení a selektivita<ul><li>Menší částice stacionární fáze a optimalizované průtokové podmínky umožňují HPLC rozlišit proteiny lišící se pouze nepatrnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Tato přesnost je zásadní pro rozlišení izoforem, mutantů a posttranslačně modifikovaných variant.</li></ul>Přesnost a reprodukovatelnost<ul><li>Automatizované systémy udržují stabilní průtok, přesnou kontrolu gradientu a citlivost detekce, čímž zajišťují reprodukovatelné výsledky nezbytné pro regulované biofarmaceutické pracovní postupy.</li></ul>Rychlost a účinnost<ul><li>Moderní systémy UHPLC vybavené plně porézními částicemi nebo částicemi typu core–shell dosahují rychlejší separace bez ztráty rozlišení a zkracují dobu analýzy až o 50 % ve srovnání s klasickými metodami.</li></ul>Kompatibilita a škálovatelnost<ul><li>Systémy HPLC jsou vysoce přizpůsobivé a podporují jak charakterizaci v analytickém měřítku, tak purifikaci v preparativním měřítku. Metody vyvinuté pro mikrogramová množství lze plynule převést na miligramová nebo gramová množství využívaná při vývoji výrobních procesů.</li></ul><h3>Faktory ovlivňující účinnost purifikace proteinů pomocí HPLC</h3>Optimalizace HPLC pro purifikaci proteinů vyžaduje nalezení rovnováhy mezi čistotou, výtěžností a produktivitou. Výsledky významně ovlivňují následující parametry:<ul><li>Cíl purifikace: Určete, zda je prioritou výtěžnost, čistota nebo produktivita. Analytické separace upřednostňují rozlišení, zatímco preparativní separace kladou důraz na výtěžnost a rychlost procesu.</li><li>Rozpustnost a stabilita proteinů: Nestabilní proteiny nebo proteiny náchylné k agregaci mohou vyžadovat nízké teploty nebo přídavek látek, jako je glycerol či šetrné detergenty.</li><li>Typ stacionární fáze a velikost částic: Zvolte vhodnou stacionární fázi (na bázi siliky, polymerní nebo typu mixed-mode) a velikost částic s ohledem na molekulovou hmotnost a hydrofobitu cílového proteinu.</li><li>pH mobilní fáze a iontová síla: pH by mělo být optimalizováno v blízkosti izoelektrického bodu (pI) proteinu, nikoli však přímo na jeho hodnotě. Solné gradienty ovlivňují jak rozlišení, tak eluční sílu.</li><li>Průtok a profil gradientu: Strmější gradienty zkracují dobu analýzy, mohou však snížit kvalitu separace.</li><li>Konečná forma purifikovaného proteinu: Při přípravě vzorku pro skladování nebo následné analýzy zvažte složení a koncentraci pufru, aby byla zachována biologická aktivita proteinu.</li></ul><h3>Osvědčené postupy pro purifikaci proteinů pomocí HPLC</h3>Dodržování správné chromatografické praxe pomáhá zajistit konzistentní a kvalitní výsledky.<ul><li>Kondicionování a skladování kolony: Nové <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=48&amp;manufacturerItems=50">HPLC kolony</a> vždy ekvilibrujte alespoň 10 objemy mobilní fáze (10 CV) a skladujte je ve vhodném rozpouštědle obsahujícím konzervační přísady.</li><li>Zabraňte srážení proteinů: Udržujte vhodnou iontovou sílu a při purifikaci nativních proteinů se vyhněte denaturačním rozpouštědlům nebo vysokému podílu organických rozpouštědel.</li><li>Minimalizujte ztráty vzorku: Používejte hadičky a vialky s nízkou adsorpcí proteinů a minimalizujte mrtvý objem systému.</li><li>Řešení problémů:<ul><li>Frontování píku: může naznačovat přetížení kolony</li><li>Rozšiřování píků: může být způsobeno nerovnoměrným průtokem mobilní fáze kolonou</li><li>Carry-over (přenos z předchozího nástřiku): lze omezit prodloužením promývacích cyklů nebo použitím účinnějších regeneračních rozpouštědel</li><li>Ucpávání kolony: vzorky před analýzou filtrujte (0,22 µm) a systém pravidelně proplachujte</li></ul></li></ul>

Purifikace proteinů pomocí HPLC: metody, výhody a osvědčené postupy

<div><div>Pátrání po zmizelém profesorovi, luštění tajných zpráv i hledání převratného léčiva. Outdoorová hra Mise Retrovirus se odehrává v pražských Dejvicích a přibližuje český výzkum, který stál u zrodu světově významných antivirotik. Inspirací k jejímu vzniku bylo blížící se 90. výročí narození chemika Antonína Holého a vznikla díky spolupráci Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR (ÚOCHB) a herního zážitkového studia Get Out Fun.</div></div><div>„Profesor Viktor Krystal zmizel a spolu s ním i klíčový výzkum nového antivirotika. Čas běží a vy jste jediní, kdo dokáže rozluštit stopy ukryté mezi šiframi, molekulami a tajnými zprávami.“ Tak začíná příběh nové hry, která je určena všem, kdo mají rádi únikové hry, dobrodružství nebo šifry. Fiktivní příběh hry přitom stojí na skutečných vědeckých poznatcích.Hra je určena hráčům od 13 let a je dostupná ve dvou variantách – jako dvouhodinová <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.getoutfun.com/hra/mise-retrovirus">venkovní hra</a> v pražských Dejvicích, která začíná na Flemingově náměstí před ÚOCHB, a <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.getoutfun.com/hra/mise-retrovirus-kdekoliv">online verze</a>, kterou si lze zahrát odkudkoliv. Cílem projektu je představit veřejnosti zábavnou formou výzkum antivirotik a přiblížit práci vědců, jejichž výzkum vedl ke vzniku moderních antivirotik.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/UOCHB_Nova_outdoorova_hra_predstavuje_cesky_vyzkum_antivirotik_2_38fdaea4b8.jpg" alt="ÚOCHB: Nová outdoorová hra představuje český výzkum antivirotik" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_UOCHB_Nova_outdoorova_hra_predstavuje_cesky_vyzkum_antivirotik_2_38fdaea4b8.jpg 208w," sizes="100vw" width="1500" height="1125">„Chemie, biochemie ani virologie nemusí zůstávat zavřené v učebnicích nebo laboratořích. Díky hře se z nich stává dobrodružství v ulicích, při kterém se hráči navíc vzdělávají. Hravost je klíčová, díky ní se i složitá témata mohou stát přístupná, zapamatovatelná a překvapivě zábavná,“ říká odborný garant hry, popularizátor vědy Oldřich Hudeček z ÚOCHB.Některé motivy ve hře odkazují na vědecký odkaz Antonína Holého, jehož objevy položily základy moderních antivirotik, která dnes pomáhají milionům pacientů po celém světě. Hra zároveň připomíná blížící se 90. výročí jeho narození.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/UOCHB_Nova_outdoorova_hra_predstavuje_cesky_vyzkum_antivirotik_3_60b7dbed48.jpg" alt="ÚOCHB: Nová outdoorová hra představuje český výzkum antivirotik" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_UOCHB_Nova_outdoorova_hra_predstavuje_cesky_vyzkum_antivirotik_3_60b7dbed48.jpg 234w," sizes="100vw" width="1500" height="1001">Propojení vědeckého tématu a hry představuje neobvyklý formát popularizace vědy. „Převést skutečné vědecké poznatky do podoby napínavé outdoorové hry pro nás byla zajímavá výzva. Podařilo se nám propojit moderní herní principy s reálnou vědou a vytvořit příběh, který hráče provede nejen zákoutími Prahy 6, ale i světem virologie a vývoje antivirotik,“ popisuje vznik hry Ivan Lukáš, obchodní ředitel Get Out Fun.<blockquote><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.getoutfun.com/hra/mise-retrovirus">Outdoorová</a> i <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://www.getoutfun.com/hra/mise-retrovirus-kdekoliv">online</a> verze hry jsou pro všechny dostupné zdarma. Ke hraní stačí mobilní telefon s aplikací Get Out Fun, která hráče provede příběhem i jednotlivými úkoly. Na podzim bude hra dostupná také v angličtině.</blockquote></div>

Nová outdoorová hra představuje český výzkum antivirotik

Vědci z CEITEC Vysokého učení technického v Brně uspěli v silné mezinárodní konkurenci a získali prestižní grant Human Frontier Science Program (HFSP), který podporuje průlomový základní výzkum. Brněnský tým vedený Ericem Danielem Glowackým přinese do mezinárodního projektu unikátní technologii, která umožňuje přesně řídit množství kyslíku v tkáních. Právě změny okysličení totiž mohou zásadně ovlivňovat, jak se buňky v raném embryonálním vývoji specializují.Projekt s názvem „Nejen teorie: regulace vzorování embryí savců pomocí elektrochemických gradientů”&nbsp;řeší CEITEC VUT v konsorciu s biology z Max Planckova institutu molekulární buněčné biologie a genetiky a Yaleovy univerzity. Role brněnského týmu je v projektu klíčová:&nbsp;dodává technologii, která umožňuje v tkáních cíleně vytvářet oblasti s různou hladinou kyslíku a sledovat, jak na tyto změny buňky reagují.„Specialitou naší výzkumné skupiny je elektrochemie, věnujeme se zejména působení elektrického proudu na okysličení tkání a sledování následných chemických změn v nich. Abychom mohli provádět určité typy experimentů, vyvinuli jsme si vlastní komplexní systém jehlových sond, elektrod a softwaru, díky nimž dokážeme ovlivňovat a kontrolovat, kolik kyslíku se vyskytuje v tkáních, kterými proud probíhá,” vysvětluje vedoucí týmu Eric Daniel Glowacki. Pomocí těchto nástrojů vědci dokážou ve vzorcích vytvářet i oblasti, v nichž je kyslíku nedostatek či dokonce zcela chybí. Právě změny hladiny kyslíku jsou pro biologii zásadní – ovlivňují metabolismus buněk a tím i jejich chování. V některých typech výzkumu je taková kontrola prostředí klíčová. „Náš systém není univerzální, pro každou aplikaci jej upravujeme na míru. Do budoucna ale chceme rozšířit jeho varianty tak, aby byl využitelný v co nejširším spektru výzkumů,“ doplňuje Glowacki.Technologii z CEITEC už v minulosti využili vědci z Max Planckova institutu při studiu raného embryonálního vývoje. Zaměřovali se na to, jak metabolická aktivita kmenových buněk (nespecializovaných buněk, které jsou schopny sebeobnovy a přeměny na specializované buňky, např. svalové, nervové nebo krevní) ovlivňuje jejich další vývoj i vývoj buněk v jejich okolí.Na tuto práci navazuje nově podpořený projekt Human Frontier Science Program (HFSP). Jeho cílem je přezkum zhruba sto let staré teorie&nbsp;amerického zoologa Charlese Manninga Childa, která vysvětluje, jak se u mnohobuněčných organismů kmenové buňky postupem času mění na zralé buňky s konkrétní funkcí a strukturou. Tříletý projekt s dotací 7,5 milionu korun pro každého z partnerů bude na myších embryích přímo v děloze ověřovat novou hypotézu, že pro konkrétní přeměnu buněk je klíčové také místo v tkáni a čas, během nějž k úbytku kyslíku dochází.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/CEITEC_Technologie_vedcu_z_CEITEC_pomuze_odhalit_jak_kyslik_ridi_vyvoj_embryi_2_1ea86be296.jpeg" alt="CEITEC/ Lukáš Havlák: Technologie vědců z CEITEC pomůže odhalit, jak kyslík řídí vývoj embryí: Technologie k projektu HFSP na CEITEC VUT." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_CEITEC_Technologie_vedcu_z_CEITEC_pomuze_odhalit_jak_kyslik_ridi_vyvoj_embryi_2_1ea86be296.jpeg 235w," sizes="100vw" width="1600" height="1067">Lepší pochopení mechanismů, které řídí raný embryonální vývoj, může v budoucnu přispět například k rozvoji regenerativní medicíny, výzkumu vývojových poruch nebo efektivnějšímu využití kmenových buněk v biomedicíně.„To, že náš projekt uspěl, je pro nás velká čest, ale i závazek. HFSP je unikátní program věnovaný primárnímu výzkumu, v němž se řešitelé snaží najít odpovědi na základní a dosud nezodpovězené otázky biologie,“,&nbsp;říká Glowacki. Úspěšnost v programu je přitom velmi nízká – uspějí pouze dvě až tři procenta z tisíců přihlášených projektů. Podmínkou je mimo jiné i mezinárodní spolupráce napříč kontinenty a zcela novátorský přístup.„Díky tomu jsme se stali součástí komunity špičkových vědců z celého světa. I když výsledky takového výzkumu nejsou okamžitě aplikovatelné, jejich dlouhodobý přínos pro společnost je zásadní,“ uzavírá Glowacki.<blockquote><h4>O HFSP</h4>Mezinárodní organizace Human Frontier Science Program Organization (HFSPO) vznikla v roce 1989 ve Francii. Myšlenka na vytvoření této mezinárodní komunity, která by se věnovala základnímu výzkumu, však vzešla ještě o několik let dříve v Japonsku.Program&nbsp;financuje špičkový výzkum v oblasti základních věd o živé přírodě, zejména biologie, fyziky, chemie, matematiky a informatiky, a podporuje inovativní, mezioborové projekty, které by se jinak financovaly jen obtížně. Finanční podporu HFSPO získává například od francouzské, japonské, švýcarské či jihokorejské vlády, dále z USA, EU, Singapuru, Nového Zélandu nebo Velké Británie. Od vzniku programu v roce 1989 získalo 31 vědců podpořených HFSP Nobelovu cenu. Zatím posledními oceněnými byli v roce 2024 David Baker za chemii (počítačový návrh proteinů) a Gary Ruvkun za fyziologii a medicínu (objev mikroRNA).</blockquote>

Technologie vědců z CEITEC pomůže odhalit, jak kyslík řídí vývoj embryí

Akademie

Popularizace

Věda a výzkum

Článek

Produkt

Je výzkumné centrum zaměřené na oblast živých věd, pokročilých materiálů a technologií.  Vznikl v roce 2011 na základech šesti významných brněnských univerzit a výzkumných institucí. Od doby jeho nedávného vzniku se daří budovat významné vědecké centrum, a již nyní se řadí mezi špičkové evropské instituce.

CEITEC

ÚOCHB AV ČR je přední mezinárodně uznávaná vědecká instituce, jejímž hlavním posláním je základní výzkum v oblasti chemické biologie a medicinální chemie, organické a materiálové chemie, chemie přírodních látek, biochemie a molekulární biologie, fyzikální chemie, teoretické chemie a analytické chemie.

Ústav organické chemie a biochemie AV ČR

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Mohlo by Vás zajímat

Technologie vědců z CEITEC pomůže odhalit, jak kyslík řídí vývoj embryí

Nová outdoorová hra představuje český výzkum antivirotik

Purifikace proteinů pomocí HPLC: metody, výhody a osvědčené postupy