Příprava vzorků pro N-vázané glykany
Phenomenex: Příprava vzorků pro N-vázané glykany
Použití destičky pro přípravu vzorků k čištění N-vázaných glykanů odštěpených z glykoproteinů
Destičky pro přípravu vzorků se osvědčily jako účinná náhrada za náročnější postupy přípravy vzorků, které následují po odštěpení glykanů z glykoproteinů pomocí enzymatického štěpení PNGázou F. Před kvantifikací metodami HPLC-UV nebo LC-MS/MS je nezbytné N-glykany označit; tradiční metody čištění jsou však časově náročné a zahrnují více kroků, což může zvyšovat riziko chyb. Čištění pomocí HILIC extrakce na pevné fázi (SPE), například s využitím mikroelučních destiček Biozen™ N-Glycan Clean-Up, ve srovnání nabízí citlivé, účinné a časově efektivní řešení. Níže je popsán pracovní postup analýzy glykanů.
Phenomenex: Příprava vzorků pro N-vázané glykany
- Vzorky glykoproteinů se rekonstituují na koncentraci 2 mg/mL v čisté vodě a denaturují přidáním 6 µL surfaktantu a zahřátím na 90 °C po dobu 3 minut. Následně se přidá 12 µL PNGázy F a vzorky se inkubují 5 minut při 50 °C. Tento krok slouží k odštěpení glykanů od glykoproteinové matrice.
- Značení se provádí pomocí kyseliny 2-aminooctové (2-AA) nebo kyseliny 2-aminobenzoové (2-AB). Uvolněné glykany se připraví s 12 µL roztoku značkovacího činidla na vzorek a inkubují se 5 minut při pokojové teplotě.
- Po fluorescenčním značení je nutné odstranit přebytečné barvivo, které je – stejně jako u jiných derivačních kroků – přítomno v nadbytku. K tomuto účelu je preferována HILIC SPE destička.
96jamková destička / Biozen N-Glycan Clean-Up
- Kondicionace: 200 µL vody
- Ekvilibrace: 200 µL voda / ACN (15:85)
- Nanesení: vzorek
- Promývání: 2 × 600 µL kyselina mravenčí / voda / ACN (1:9:90)
- Eluce: 3 × 30 µL 200 mM octanu amonného v ACN/vodě (5:95)
- Ředění: 100 µL dimethylformamidu a 210 µL ACN
Tento krok eluuje glykany do vodného pufru, avšak glykany se běžně namísto HPLC metody separují metodou HILIC, kde by vysoký podíl vodné složky působil jako silné rozpouštědlo, což není pro HILIC ideální. Z tohoto důvodu jsou mikroeluční destičky preferovanou platformou pro čištění, protože minimalizují množství vodného pufru ve vzorku a snižují vliv silného rozpouštědla při následné analýze. Takto připravené vzorky značených glykanů jsou připraveny k analýze pomocí kolony určené pro analýzu glykanů.
