Tipy a triky v HPLC: Derivatizační techniky

Použití derivatizace v HPLC

Derivatizace v HPLC se používá z několika ryze praktivkckých důvodů:

• zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec
• zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec
• zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně

Způsoby derivatizace

Podle místa derivatizace můžeme rozdělit derivatizační techniky na tři kategorie:

• Předkolonová derivatizace (pre-column chromatography); chemická reakce probíhá před kolonou
• Postkolonová derivatizace (post-column chromatography); chemická reakce probíhá za kolonou
• Derivatizace na koloně; chemická reakce probíhá přímo v koloně

Všechny způsoby derivatizace mají vliv na eluční charakteristiky separovaných látek (účinnost separace a dobu analýzy), ale požadavky na deriváty a derivatizařní reakce jsou poněkud odlišné.

Požadavky na deriváty předkolonové derivatizace

1. derivát musí být chemické individuum a měl by být dostatečně stabilní
2. derivatizační reakce musí probíhat kvantitativně
3. derivatizační reakce nemusí probíhat rychle
4. reakce by měla být pokud možno selektivní
5. reakce by měla být bez vedlejších produktů a měla by probíhat za mírných reakčních podmínek (pH, teplota) tak, aby nebyla nutná předseparace vzniklého individua
6. při použití nadbytku derivatizačního činidla musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně a pokud možno by mělo mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti (nevykazuje fluorescenční vlastnosti)

Z předešlého výčtu je zřejmé, že předkolonová derivatizace vyžaduje poměrně velkou experimentální náročnost a zkušenost operátora (reprodukovatelnost výsledků).

Požadavky na deriváty postkolonové derivatizace

1. derivatizační reakce nemusí poskytovat jednoznačné chemické individuum
2. derivatizační reakce nemusí probíhat kvantitativně, ale rozhodující je dobrá reprodukovatelnost chemické reakce
3. derivatizační reakce musí probíhat rychle, reakce může probíhat za extrémních podmínek (pH, teplota)
4. používá se nadbytek reakčního činidla a dochází tak ke zřeďování mobilní fáze činidlem a dochází ke snížení účinnosti separace vlivem rozmytí chromatografické zóny
5. reakce může být neselektivní, vedlejší produkty reakce nejsou na závadu
6. není nutné hledat nové podmínky separace, neboť se vzorek separuje v nezměněné podobě
7. vysoké náklady na techniku, neboť se musí používat speciální zařízení a reaktory, v nichž je nutno provádět řadu operací, výhodou je automatizace procesu derivatizace
8. veškeré manuální operace jsou eliminovány

Reaktory používané za chromatografickou kolonou

Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. Popis postkolonové derivatizace naleznete zde.

Derivatizační činidla a reakce pro jednotlivé organické skupiny

Aplikované derivatizační reakce vedoucí k tvorbě detekovatelných derivátů v oblasti HPLC můžeme rozdělit do několika skupin:

1. deriváty vhodné k detekci v oblasti UV_VIS spektra
2. deriváty vhodné k detekci fluorimetrické
3. deriváty vhodné k detekci radiochemické
4. deriváty vhodné k detekci elektrochemické
5. deriváty vhodné k detekci atomovou absorpční spektrofotometrií

Deriváty pro detekci v ultrafialové a viditelné oblasti spektra

1.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny 1.2 Činidla pro karboxylové kyseliny 1.3 Činidla pro hydroxyderiváty 1.4 Činidla pro karbonylskupinu

Detaily na webu hplc.cz/

Deriváty pro fluorimetrickou detekci

Účelem této techniky je zavést do molekuly takovou skupinu, která vykazuje fluorescenční vlastnosti, a umožní tak detekci těchto látek. Tyto deriváty vykazují detekční limit až o tři řády nižší než deriváty detekované v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Pro praktické použití fluoroderivátů by měly platit určité předpoklady:

• rychlá a kvantitativní reakce za mírných podmínek (vodně-organická rozpouštědla, laboratorní teplota)
• tvorba nepolárních derivátů dovolující jejich extrakci do nepolárních rozpouštědel
• specifičnost pro danou funkční skupinou
• nadbytek derivatizačního činidla musí být snadno separován od jeho produktů
• deriváty by měly mít uspokojivé chromatografické vlastnosti a měly by být dostatečně stabilní

2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny 2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu 2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu

Detaily na webu hplc.cz/

Další derivatizační reakce používané v HPLC

Zajímavé derivatizační reakce využitelné v HPLC naleznete zde.