Využití LC-MS/MS systémů ve fytochemickém výzkumu plodů třešní

ÚVOD

Třešně a višně jsou tradičně považovány za bohatý zdroj biologicky aktivních látek, jako jsou antokyany, vitamíny či karotenoidy, s pozitivním vlivem na lidské zdraví. Cílem naším práce bylo vyvinout a zavést analytickou metodu, která by umožnovala hodnotit obsah bioaktivních látek u třešní z Portugalska a České republiky. K tomu jsme využili spojení kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí, kterou předcházela na jednoduchá příprava vzorků.

ANALÝZA TŘEŠNÍ UHPLC-MS/MS

V první fázi byl použit systém lineární iontové pasti LTQ XL ve spojení s pumpou Ultimate 3000 pro zjištění profilu fenolických, případně zajímavých flavonoidních látek s antioxidační aktivitou. V návaznosti na provedené profilování byly dále stanoveny vybrané látky.

Pro stanovení těchto antioxidantů v plodech třešní byl použit systém sestavený z ultraúčinného kapalinového chromatografu (UltiMate 3000 Binary RSLC) a tandemového hmotnostního spektrometru s trojitým kvadrupólem (TSQ Quantum Access Max) vybaveného ionizací elektrosprejem (H-ESI). Pro chromatografickou separaci byla použita kolona Hypersil GOLD, 50 x 2,1 mm, 1,9 μm (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) s univerzální předklonkou při teplotě 30 °C. Byla použita gradientová eluce. Průtok mobilní fáze byl 0,3 ml/min a nástřikový objem byl 10 µl. Mobilní fáze A obsahovala 0,1 obj. % mravenčí kyseliny ve vodě, mobilní fáze B obsahovala 0,1 obj. % mravenčí kyseliny v methanolu.

Úprava vzorků byla následující: z homogenizovaných vzorků třešní byl zpracován extrakt s 5 ml 100% methanolu s přídavkem 2 obj. % kyseliny mravenčí.

VÝSLEDKY

Na Obr. 2 jsou prezentovány přehlednou formou dosažené výsledky. V třešňových plodech bylo zjištěno významné množství flavonoidu rutinu, který příznivě ovlivňuje složení cévní stěny a její pružnost. Kvercetin byl detekován jen stopově, což je odrazem míry stability rutinu v plodech po sklizni.

Radanal: Obr. 2: Grafické porovnání celkového množství dominantních antioxidantů ve vzorcích třešní z Holovous , sklizeň r. 2017

Amygdalin, Obr. 3, byl zjištěn s většími množstevními výkyvy, neboť tato látka je lokalizována především v semenech (jádrech pecek). Jeho výsledná množství jsou odrazem difúze přes osemení do dužniny plodu.

Radanal: Obr.3 : Hmotnostní spektrum amygdalinu s vyznačenými hodnotami m-z nejdůležitějších produktových iontů

Kyselina syringová, Obr.1, v odborné literatuře často uváděná jako typická organická kyselina vyskytující se v plodech třešní, byla nalezena ve výrazně nižším množství než výše popsané antioxidanty. V poměru epikatechin/katechin byl shledán výrazně vyšší podíl epikatechinu. Chlorogenová kyselina byla zaznamenána v podstatně nižších množstvích, kyselina ferulová pak prakticky jen stopově.

Radanal: Obr.1: Pseudochromatogram kyseliny syringové