Simultaneous Analysis of Hydrophilic Metabolites Using Triple Quadrupole LC/MS/MS

Význam tématu

Analýza hydrofilerických primárních metabolitů je zásadní pro pochopení centrálních metabolických drah v buňkách. Díky simultánnímu sledování aminokyselin, sacharidů, nukleotidů a koenzymů lze získat detailní obraz biologických změn v tkáních i biologických vzorcích, což je klíčové pro výzkum, diagnostiku a kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje metodiku pro současné stanovení více než 50 hydrosolubilních metabolitů pomocí iontově-párové chromatografie v kombinaci s triple kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem Shimadzu LCMS-8040. Hlavním cílem bylo demonstrovat separaci a kvantifikaci klíčových metabolitů a ověřit vliv doby přípravy vzorků na analytickou výtěžnost.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda využívá:

• Reverzní fázi C18; kolona Mastro C18 (2,0 × 150 mm, 3 µm)
• Iontově-párovací činidlo tributylamin v mobilní fázi (15 mmol/l ac. acid, 10 mmol/l tributylamin)
• Mobilní fáze B: methanol; gradientní eluce 0–20 min
• Flow rate 0,3 ml/min, teplota kolony 40 °C, injekční objem 3 µl
• Hmotnostní spektrometr LCMS-8040, ESI v negativním módu, napětí –3,5 kV, plyny: nebulizační 2 l/min, sušicí 10 l/min, DL temp. 250 °C, heat block 400 °C
• MRM (multiple reaction monitoring) pro selektivní detekci 55 metabolitů
• Vzorková příprava: homogenizovaná jaterní tkáň myší, extrakce methanol-chloroformem, test stability po 0, 2 a 10 minutách při RT

Hlavní výsledky a diskuse

KRM chromatogramy ukázaly odlišné chování různých metabolitů během prodlevy před extrakcí. ATP a ADP vykazovaly rapidní pokles, zatímco AMP, jejich degradační produkt, rostl s časem. Naopak glutamát zůstal stabilní. Tyto výsledky potvrzují, že čas přípravy vzorku významně ovlivňuje kvantifikaci nestabilních sloučenin.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Komplexní monitorování primárního metabolismu v biologických vzorcích
• Vyšší citlivost a selektivitu díky MRM režimu
• Minimalizaci chyb měřením vlivu přípravy vzorku
• Aplikace v klinickém výzkumu, metabolomice i QA/QC v průmyslové analýze

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj se zaměří na:

• Automatizaci přípravy vzorků pro zvýšení reprodukovatelnosti
• Rozšíření panelu o labilní nebo nízko-abundantní metabolity
• Integraci s vysokorozlišovacími analyzátory pro neznámé metabolity
• Biomarkerové studie v personalizované medicíně

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda s iontově-párovou chromatografií je efektivní nástroj pro simultánní stanovení širokého spektra hydrofilerických metabolitů. Klíčovým faktorem pro přesnost je rychlá a konzistentní příprava vzorku. Metoda nachází uplatnění v různých oblastech biochemického výzkumu a klinické diagnostiky.

Reference

1. Shimadzu Corporation. LC-MS/MS method package for Primary Metabolites. First Edition: June, 2014.