An Integrated Workflow for Sensitive Intact Protein Quantitation of Monoclonal Antibodies from Biological Matrix

Význam tématu

Monoklonální protilátky jsou klíčovou třídou bioterapeutik používaných v léčbě různých onemocnění. Jejich přesné stanovení v biologických vzorcích je zásadní pro farmakokinetické studie, kontrolu kvality a vývoj nových léčiv. Klasické bottom up metody založené na enzymatické digesci často postrádají citlivost a schopnost simultánního měření různých proteoform. Přímá analýza intact proteinů pomocí LC MS usnadňuje kvantifikaci heterogenních směsí protilátek s různými modifikacemi.

Cíle a přehled studie

Tato práce představuje integrovaný workflow pro citlivou kvantifikaci intact monoklonálních protilátek v sérovém matrici. Spojení Agilent AssayMAP Bravo pro přípravu vzorků s LC Q TOF systémem Agilent 6545XT AdvanceBio umožňuje dosáhnout nízkých detekčních mezí, širokého dynamického rozsahu a vysoké reprodukovatelnosti. Studie testovala diluce standardu trastuzumabu v čistém roztoku i ve vzorcích myšího séra.

Použitá metodika a instrumentace

• Automatizovaná platforma Agilent AssayMAP Bravo se streptavidinovým cartridgem pro imunoadsorpci a obohacení intact protilátek
• Agilent 1290 Infinity II LC systém: vysokorychlostní pumpa, multisampler, termostatizovaná kolona compartment
• Kolona PLRP S (2,1 × 50 mm, 1000 Å, 5 µm); mobilní fáze 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě a v acetonitrilu; gradient od 0 do 70 % B během 4 minut; teplota kolony 80 °C; průtok 0,5 mL/min
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC Q TOF se zdvojenou Agilent JetStream ESI zdrojem
• MS parametry: teplota plynu 350 °C, tok 12 L/min, tlak mlžení 60 psi, teplota pláště 400 °C, VCap 5500 V, fragmentor 380 V, rozsah m/z 500 8000, akviziční režim pozitivní rozšířený mass range
• Software Agilent MassHunter Acquisition a MassHunter Quantitative Analysis s funkcí SWARM autotune

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaná LC MS metoda pro intact protilátky v neat roztoku trastuzumabu dosáhla: LOD na kolóně 0,025 ng, LOQ 0,05 ng, dynamický rozsah 0,025–50 ng/µL, kalibrace s R2 = 0,9955. Ve vzorcích myšího séra bylo možné kvantifikovat intact protilátku v koncentracích 35–50000 ng/mL s LOD 35 ng/mL (0,105 ng na kolóně), LOQ 50 ng/mL (0,15 ng na kolóně), R2 = 0,9966. Klíčem k citlivosti bylo selektivní imunoadsorpční obohacení na AssayMAP Bravo, vysokoteplotní rychlá chromatografie PLRP S kolony a optimalizované zpracování dat (sumace nejintenzivnějších 5 nábojových stavů a u glykoproteinů 2 nejhojnějších forem).

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí:

• Vysokou citlivost v řádu pikogramů
• Široký dynamický rozsah vhodný pro PK studie
• Automatizovanou a reprodukovatelnou přípravu vzorku
• Schopnost analyzovat heterogenní proteoformy v jednom běhu
• Rychlou metodu vhodnou pro rutinní nasazení v biopharma QA a výzkumu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj očekáváme v oblasti integrace plně automatických platforem pro intact protein analýzu, vylepšené citlivosti MS díky novým iontovým optikám a algoritmům zpracování dat, miniaturizaci likvidní chromatografie a rozšíření na komplexní proteoformní profilování a konjugované protilátky (ADC).

Závěr

Prokázaný workflow spojující AssayMAP Bravo a Agilent 6545XT AdvanceBio LC Q TOF umožňuje vysoce citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci intact monoklonálních protilátek v sérové matrici s nízkými detekčními a kvantifikačními mezemi a širokým dynamickým rozsahem. Metoda se jeví jako perspektivní nástroj pro farmakokinetické studie i kontrolu kvality v biotechnologickém průmyslu.

Reference

1. Precise Characterization of Intact Monoclonal Antibodies by the Agilent 6545XT AdvanceBio LC Q TOF Agilent Technologies Application Note 5991 7813EN 2019
2. Vasicek L et al Direct Quantitation of Therapeutic Antibodies for Pharmacokinetic Studies using Immuno purification and Intact Mass Analysis Bioanalysis 2019 11 3 203 213
3. Han M et al Immunoaffinity Capture Coupled with Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry to Study Therapeutic Protein Stability In Vivo Anal Biochem 2017 539 118 126
4. A Streamlined Drug to Antibody Ratio Determination Workflow for Intact and Deglycosylated Antibody Drug Conjugates Agilent Technologies Application Note 5991 9010EN 2019