Agilent AdvanceBio N-Glycanase (PNGase F) ≥2.5 U/mL - Data Sheet

Význam tématu

Oddělení N-vázaných oligosacharidů z glykoproteinů je zásadní pro pochopení jejich struktury i funkce a zároveň umožňuje přípravu vzorků pro metody hmotnostní spektrometrie, krystalografie nebo molekulární hmotnostní stanovení.

Cíle a přehled studie

Tento dokument popisuje enzymatický preparát Agilent AdvanceBio N-Glycanase (PNGase F) a jeho charakterizaci včetně aktivity, stability, specifity štěpení a doporučených podmínek použití pro uvolňování intaktních N-vázaných glykanů z glykoproteinů a glykopeptidů.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzym PNGase F s aktivitou ≥2.5 U/mL (specifická aktivita ≥10 U/mg), molekulární hmotnost ~35 kDa
• Formulace: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, sterilně filtrací očista
• Dodávané reagencie: WS0010 5× sodium-fosfátový buffer pH 7.5; WS0145 5× Tris-HCl buffer pH 8.0; WS0012 denaturační roztok (2 % SDS, 1 M β-MER); WS0013 neiontový detergent (15 %)
• Deglykozylace za denaturačních podmínek: zahřátí vzorku na 100 °C v přítomnosti SDS (0.1 %) a β-MER (50 mM), následná inkubace s enzymem při 37 °C (2 h až přes noc)

Hlavní výsledky a diskuse

Produkt vykazuje vysokou čistotu bez detekovatelné exoglykosidázové či proteázové aktivity. Štěpí specificky vazbu mezi asparaginem a prvním N-acetyl-glukosaminem ve většině oligomannózových, hybridních i komplexních N-glykanech, přičemž uvolňuje intaktní oligosacharidy. Optimální pH činí 8.6 (rozsah 7.5–9.5) a enzym je aktivní v přítomnosti močoviny (≤5 M), guanidinium chloridu (≤2 M) a NaSCN (≤0.25 M), avšak je inhibován guanidinium thiocyanátem a iontovými detergenty. Pro delší inkubace se doporučuje teplota 25 °C.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivou a reprodukovatelnou analýzu intaktních N-glykanů pro strukturní studia, kvantifikaci v glykomice, určování molekulové hmotnosti glykoproteinů nebo přípravu vzorků pro krystalografii. Díky kompatibilitě s neiontovými detergenty je vhodná i pro následné analýzy hmotnostní spektrometrií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se vývoj variant PNGase F s vyšší termostabilitou a odolností vůči náročným denaturačním činidlům, plná automatizace postupů v glykomických pracovních postupech a integrace s pokročilými technikami kvantitativní hmotnostní spektrometrie pro komplexní profilování glykanů.

Závěr

Agilent AdvanceBio N-Glycanase (PNGase F) je robustní a vysoce čistý enzymatický nástroj pro účinné uvolňování N-vázaných glykanů za široké škály podmínek. Vysoká aktivita, stabilita a kompatibilita s denaturačními činidly zaručují jeho univerzální využití v analytické chemii a biologii.

Reference

• Barsomian GD et al Cloning and Expression of Peptide N4 Asparagine Amidase F in Escherichia coli J Biol Chem 1990 265 6967–6972
• Tarentino AL et al Molecular Cloning and Amino Acid Sequence of Peptide N4 Asparagine Amidase from Flavobacterium meningosepticum J Biol Chem 1990 265 6961–6966
• Twining SS Fluorescein Isothiocyanate Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes Anal Biochem 1984 143 30–34
• Chu FK Requirements of Cleavage of High Mannose Oligosaccharides J Biol Chem 1986 261 172–177
• Tretter V Altmann F Marz L Peptide N4 Asparagine Amidase F Cannot Release Glycans with α1 3 Fucose Eur J Biochem 1991 199 647–652
• Maley F et al Characterization of Glycoproteins Through the Use of Endoglycosidases Anal Biochem 1989 180 195–204
• Plummer TH Demonstration of PNGase F Activity in Endoglycosidase F Preparations J Biol Chem 1984 259 10700–10704
• Tarentino AL Gomez CM Plummer TH Deglycosylation of Asparagine Linked Glycans Biochem 1985 24 4665–4671
• Plummer TH Tarentino AL Purification of Oligosaccharide Cleaving Enzymes of Flavobacterium meningosepticum Glycobiology 1991 1 257–263
• Tarentino AL Plummer TH Deglycosylation of Asparagine Linked Glycans Meth Enzymol 1994 230 44–57
• Elder JH Alexander S Endo β N Acetylglucosaminidase F that Cleaves Both High Mannose and Complex Glycoproteins PNAS 1982 79 4540–4544
• Montreuil J et al Carbohydrate Analysis A Practical Approach IRL Press 1994
• Muramutsu T CRC Handbook of Endoglycosidases and Glycoamidases CRC Press 1992
• Mann AC Self CH Turner GA A General Method for Complete Deglycosylation of Serum Glycoproteins Using PNGase F Glycosylation & Disease 1994 1 253–261
• Tanner MJA et al Effect of Endoglycosidase F Preparations on Human Erythrocyte Carbohydrate Res 1988 178 203–212