Agilent AdvanceBio N-Glycanase (PNGase F, EDTA-Free), ≥2.5 U/mL - Data Sheet

Význam tématu

Komplexní analýza N-vázaných sacharidů (N-glykosylace) je klíčová pro charakterizaci glykoproteinů v biotechnologii, farmacii a biologickém výzkumu. Odstranění glykanů umožňuje studium jejich struktury, funkce i vlivu na stabilitu a biologickou aktivitu proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Datový list představuje enzym Agilent AdvanceBio N-Glycanase (PNGase F, EDTA-Free) s aktivitou ≥2,5 U/mL. Popisuje vlastnosti, doporučené pracovní podmínky, protokol deglykosylace a skladovací doporučení.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzymatická uvolnění N-glykanů za použití PNGase F bez EDTA v pufrech Tris-HCl (pH 7,5–8,6).
• Příprava vzorku: denaturace glykoproteinu pomocí SDS a β-merkaptethanolu, zahřátí na 100 °C.
• Stabilizace reakce netoxickými noniontovými detergenty (NP-40, Triton X-100).
• Analýza výsledků pomocí SDS-PAGE.
• Základní potřeby: centrifugační mikrotubusy, vodní lázeň nebo termoblok, SDS-PAGE aparatura.

Hlavní výsledky a diskuse

Enzym vykazuje specificitu pro většinu oligosacharidů bez inhibičního vlivu sialových či sulfátových skupin, avšak glykanové struktury nesoucí α(1-3) fukózu v jádru nejsou štěpeny. Jeden enzymový stupeň (U) definuje uvolnění N-glykanů z 1 µmol denaturované ribonukleázy β za minutu při pH 7,5 a 37 °C. Prodlužování inkubace při 25 °C zvyšuje stabilitu enzymu. Absence kontaminujících exoglykosidáz a proteáz byla potvrzena standardními testy.

Přínosy a praktické využití metody

• Uvolnění intaktních N-glykanů vhodných pro následnou hmotnostní spektrometrii a chromatografii.
• Studium struktury a funkce glykoproteinů.
• Příprava vzorků pro krystalografii nebo určení molekulové hmotnosti.
• Podpora QA/QC procesů ve farmaceutické výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace deglykosylace s robotizovanými a vysokopropustnými glykomickými platformami, kombinace s LC-MS a vývoj enzymů s rozšířeným spektrem specificity a vyšší odolností vůči denaturačním podmínkám.

Závěr

Agilent AdvanceBio N-Glycanase (EDTA-Free) nabízí spolehlivou a čistou metodu pro odstranění N-glykanů z peptidů i proteinů. Díky vysoké aktivitě, specificitě a kompatibilitě s běžnými analytickými technikami je vhodný pro široké spektrum aplikací v laboratoři i průmyslu.

Reference

• Twining SS (1984) Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes. Analytical Biochemistry 143(1):30–34
• Chu FK (1986) Requirements of Cleavage of High Mannose Oligosaccharides in Glycoproteins by Peptide N-Glycosidase F. Journal of Biological Chemistry 261:172–177
• Tretter V, Altmann F, Marz L (1991) Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)Asparagine Amidase F Cannot Release Glycans With Fucose Attached α1-3 to the Asparagine-Linked N-Acetylglucosamine Residue. European Journal of Biochemistry 199(3):647–652
• Maley F et al. (1989) Characterization of Glycoproteins and Their Associated Oligosaccharides Through the Use of Endoglycosidases. Analytical Biochemistry 180(2):195–204
• Plummer TH Jr et al. (1984) Demonstration of Peptide N-glycosidase F Activity in Endo-β-N-Acetylglucosaminidase F Preparations. Journal of Biological Chemistry 259:10700–10704
• Tarentino AL, Gomez CM, Plummer TH (1985) Deglycosylation of Asparagine-Linked Glycans by Peptide:N-Glycosidase F. Biochemistry 24:4665–4671
• Tarentino AL, Plummer TH (1987) Peptide-N4-(N-Acetyl-β-Glucosaminyl)Asparagine Amidase and Endo-β-N-acetylglucosaminidase from Flavobacterium meningosepticum. Methods in Enzymology 138:770–778
• Plummer TH, Tarentino AL (1991) Purification of the Oligosaccharide-Cleaving Enzymes of Flavobacterium Meningosepticum. Glycobiology 1(3):257–263
• Tarentino AL, Plummer TH (1994) Deglycosylation of Asparagine-Linked Glycans: Purification, Properties, and Specificity of Oligosaccharide-Cleaving Enzymes from Flavobacterium meningosepticum. Methods in Enzymology 230:44–57
• Elder JH, Alexander S (1982) Endo-β-N-Acetylglucosaminidase F: Endoglycosidase from Flavobacterium meningosepticum that cleaves both high-mannose and complex glycoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 79(15):4540–4544
• Montreuil J et al. (1994) Carbohydrate Analysis: A Practical Approach. IRL Press
• Muramutsu T, ed. (1992) CRC Handbook of Endoglycosidases and Glycoamidases. CRC Press
• Mann AC, Self CH, Turner GA (1994) A General Method for the Complete Deglycosylation of a Wide Variety of Serum Glycoproteins Using Peptide-N-glycosidase-F. Glycosylation and Disease 1(4):253–261
• Tanner MJA et al. (1988) Effect of Endoglycosidase F-Peptidyl N-Glycosidase F Preparations on the Surface Components of the Human Erythrocyte. Carbohydrate Research 178:203–212
• Barsomian GD et al. (1990) Cloning and Expression of Peptide-N4-(N-Acetyl-β-D-Glucosaminyl)Asparagine Amidase F in Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 265:6967–6972
• Tarentino AL et al. (1990) Molecular Cloning and Amino Acid Sequence of Peptide-N4-(N-acetyl-β-D-Glucosaminyl)Asparagine Amidase from Flavobacterium meningosepticum. Journal of Biological Chemistry 265:6961–6966