LC-MS/MS method development of aflibercept using Fab-selective proteolysis nSMOL technology

Význam tématu

Analýza biotechnologického léčiva afliberceptu v biologických matricích je zásadní pro optimalizaci dávek při léčbě onemocnění sítnice. Malý objem intraokulární tekutiny vyžaduje citlivé a selektivní metody pro stanovení koncentrace proteinu v rozsahu nízkých mikrogramů na mililitr.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci afliberceptu v lidské plasmatické matrici za použití nSMOL technologie selektivní proteolýzy pro Fab fragmenty. Metoda kombinuje confirmaci primární struktury pomocí Q-TOF a kvantifikaci s triple kvadrupólem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro selektivní štěpení Fab fragmentu afliberceptu byla použita nSMOL Antibody BA Kit obsahující Protein A pryskyřici a trypsin fixovaný na nanočásticích. Peptidový digest byl analyzován na LCMS-9030 pro výběr signature peptidů a na LCMS-8060 pro MRM kvantifikaci.

• LC-MS/MS systémy Shimadzu Nexera X2/X3 a LCMS-9030, LCMS-8060
• Kapitální sloupce C18, 1.9 a 3 μm, délky 50 až 100 mm
• Mobilní fáze kyselina mravenčí/voda a acetonitril s gradientním programem
• MRM přechody optimalizované na peptidy IIWDSR, TNYLTHR a FLSTLTIDGVTR

Hlavní výsledky a diskuse

Ze sekvenční analýzy bylo identifikováno několik kandidátních signature peptidů. Peptid IIWDSR dosáhl nejvyšší citlivosti a reprodukovatelnosti (LLOQ 0.049 μg/mL, lineární rozsah 0.049 až 200 μg/mL). Validace prokázala hodnoty mezní koncentrace, přesnost (accuracy 91 až 104 %) a opakovatelnost (CV < 8 %) v souladu s doporučením ministerstva zdravotnictví.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje kvantifikovat aflibercept z minimálního objemu vzorku (5 μL) s vysokou selektivitou díky selektivní proteolýze Fab fragmentu. Postup lze aplikovat pro monitorování farmakokinetiky a terapeutického nákladu v klinických studiích a QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření nSMOL přístupu na další terapeutické protilátky a fúzní proteiny. Integrace vysokoproduktivních autosamplerů a vývoj multiplexních MRM metod pro současné stanovení vícero léčiv a metabolit.

Závěr

Byla vyvinuta robustní LC-MS/MS metoda pro stanovení afliberceptu s použitím selektivní proteolýzy nanočásticemi. Metoda prokázala vysokou citlivost, přesnost a reprodukovatelnost v širokém dynamickém rozmezí a je vhodná pro klinickou i průmyslovou praxi.

Reference

Nebyla uvedena žádná literatura.