A new method for the analysis of increased D-amino acids in proteins due to aging

Význam tématu

Racemizace aminokyselin v proteinech vede se stářím k nárůstu D-asparágové kyseliny v tkáních (čočka, kosti, tepny) a souvisí s kataraktou, aterosklerózou či Alzheimerovou nemocí. Kvantifikace těchto isomerů je klíčová pro molekulární index stárnutí.

Cíle a přehled studie / článku

Popisovat vývoj metodiky mikroflow LC-MS/MS pro detekci a kvantifikaci D-aminokyselin v proteinech bez potřeby derivatizace; představit cílenou analýzu MRM na triple kvadrupólovém přístroji; aplikovat metody na α-krystalin čočky lidského oka.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: homogenizace čočky, oddělení rozpustné (WS) a nerozpustné (WI) frakce, trypsinová štěpení na peptidy.
• Komplexní analýza (shotgun): Nano LC-MS/MS pro identifikaci a separaci Asp isomerů podle retence.
• Cílená analýza (MRM): Mikroflow LC (Nexera Mikros, 5 µL/min) v kombinaci s triple kvadrupólem LCMS-8060NX s Micro ESI-8060, optimalizace MRM přechodů pro jednotlivé peptidy.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda LC-MS/MS odhalila čtyři Asp isomery (Lα, Lβ, Dα, Dβ) pro pozici 58 v αA-krystalinu s odlišnými časy eluace. Cílená MRM analýza potvrdila nárůst Dβ-Asp ve vysokomolekulárních agregátech αA-krystalinu z čočky dvacetiletého jedince, což koreluje s proteinovou insolubilizací.

Přínosy a praktické využití metody

Minimalizace doby analýzy a objemu vzorku oproti diastereomerním derivatizačním přístupům; zvýšení citlivosti cca 10× díky mikroflow režimu; možnost detekce a kvantifikace isomerizace v nízce exprimovaných proteinech; aplikace v klinické diagnostice a výzkumu aging-related biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Kombinace shotgun a cílené MRM proteomiky pro objevování dosud neznámých D-isomerů v patologických tkáních (neurodegenerativní onemocnění, ateroskleróza); rozšíření metodiky na další posttranslační modifikace a kvantitativní profiling biomarkerů stárnutí.

Závěr

Popsané mikroflow LC-MS/MS a MRM metody umožňují přímou, vysoce citlivou a rychlou kvantifikaci D-aminokyselin v proteinech bez derivatizace. Tyto přístupy otevírají nové možnosti molekulárního hodnocení aging-related změn proteinových struktur.

Reference

1. Fujii N. et al. BBA-Proteins and Proteomics 1866, 840-847 (2018)
2. Fujii N. et al. J. Biochem. 116, 663-669 (1994)
3. Fujii N. et al. J. Biol. Chem. 287, 39992-40002 (2012)
4. Maeda H. et al. Anal. Chem. 87, 561-568 (2015)