Targeted metabonomic study of plasma from rats with acute colitis using LCMS-IT-TOF based metabonomics

Význam tématu

Metabonomika nabízí komplexní pohled na změny endogenních metabolitů a je klíčová pro včasnou a necitlivou detekci onemocnění střev, jako je akutní kolitida. Schopnost identifikovat specifické biomarkery v krevní plazmě zvířecích modelů otvírá cestu k neinvazivním diagnostickým metodám a lepšímu porozumění patofyziologii zánětů

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a aplikovat cílenou LCMS-IT-TOF metodiku pro screening potenciálních biomarkerů v plazmě potkanů s experimentálně vyvolanou akutní kolitidou (TNBS model) a srovnat je s kontrolními vzorky zdravých jedinců. Práce zahrnovala přístupy od přípravy vzorků přes chemometrickou analýzu až po identifikaci sloučenin

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorků:

• Odběr krve (1,5 mL) z očního plexu přiheparinizovaný roztokem sodného heparinu.
• Centrifugace (3 500 g, 10 min) a izolace plazmy.
• Extrahování 200 µL plazmy methanol–acetonitril–aceton (1:1:1) s interním standardem DL-2-chlorofenylalaninem, centrifugace (10 000 rpm, 15 min, 4 °C) a sušení dusíkem.
• Rekonce trace v 80 µL methanolu a 20 µL vody, následná centrifugace (10 000 rpm, 20 min, 4 °C).

Instrumentace LCMS-IT-TOF (Shimadzu):

• Chromatografie: Shim-pack XR-ODSIII, gradient 0,1 % HCOOH vs. acetonitril, 0,3 mL/min, 40 °C.
• Ionizace ESI v pozitivním a negativním módu (±4,5 kV/−3,5 kV).
• Analýza dat: Profiling Solution pro předzpracování, Simca-P pro OPLS modelování a statistiku VIP, P hodnoty.

Hlavní výsledky a diskuse

Stabilitu metody potvrzují RSD hodnoty (<4 % pro plochu signálu, <0,3 % pro retenci). OPLS model jasně oddělil TNBS a kontrolní skupinu. Z analýzy získaných m/z a MSn spekter bylo vybráno 8 potenciálních markerů:

• p-cresol glucuronide (ESI−, R.T. 5,65 min, ↑ u TNBS)
• phenylacetylglycine (ESI+/−, R.T. 5,56 min, ↑ u TNBS)
• butyrylcarnitin (ESI+, R.T. 3,29 min, ↓ u TNBS)
• eikosatetraenová kyselina (arachidová kyselina, ESI−, R.T. 16,67 min, ↑ u TNBS)
• LysoPC(16:0), LysoPC(18:0), LysoPC(18:2), LysoPC(18:1) (ESI+, R.T. 13–16 min, ↑ u TNBS)

Vysoké VIP (>2,2) a nízké P hodnoty (<0,05) potvrzují význam těchto markerů pro rozlišení mezi skupinami. Zvýšené lysofosfolipidy odrážejí zánětlivou aktivaci enzymů PLA2 a změny membránového metabolismu

Přínosy a praktické využití metody

• Neinvazivní screening biomarkerů pro včasnou diagnostiku zánětlivých onemocnění střev.
• Metoda kombinuje vysokou citlivost LCMS-IT-TOF s robustními chemometrickými nástroji.
• Přenositelnost workflow do preklinických i klinických studií a možnost sledování farmakodynamiky léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s dalšími „omics“ platformami a multi-platformními datovými analýzami.
• Automatizované, vysoko-objemové přístupy pro klinický provoz a screening populací.
• Využití strojového učení a umělé inteligence pro predikci a validaci biomarkerů.
• Personalizovaná medicína: sledování odpovědi na terapii v reálném čase.

Závěr

Vyvinutá LCMS-IT-TOF metoda pro cílenou metabonomiku plazmy prokázala vysokou přesnost a reprodukovatelnost. Identifikace osmi biomarkerů pavesla cestu k neinvazivnímu monitoringu akutní kolitidy a poskytuje důležité poznatky o metabolických změnách spojených se střevním zánětem

Reference

• Shen L., Zhang X., Yao J. et al. Targeted metabonomic study of plasma from rats with acute colitis using LCMS-IT-TOF based metabonomics. Pittcon 2016, abstrakt PO-CON1620E.