Back to Basics - Gradient Retention Factor, K*
Technické články | 2020 | ShimadzuInstrumentace
Gradientní retence je klíčová pro separaci složitých směsí s širokým rozsahem polarity. Parametr k* (gradientní retenční faktor) umožňuje normalizovat podmínky a porovnávat různé chromatografické metody, optimalizovat dobu analýzy a snižovat spotřebu rozpouštědel při zachování požadované selektivity.
Článek definuje gradientní retenční faktor k*, popisuje parametry ovlivňující jeho hodnotu a ukazuje, jak udržet konstantní k* při změně délky gradientu. Součástí je výpočetní příklad pro přizpůsobení metody z dlouhého 10min gradientu na kratší 5min provoz bez ztráty rozlišení.
Pro stanovení k* bylo využito gradientní vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) s C18 kolonnou 100×3,0 mm, 3 μm částicemi. Vrcholový tvar a retenční časy byly sledovány detektorem UV-Vis. Pro výpočet objemu prázdného prostoru kolony (Vm) byly použity rovnice:
Konstantu S odhadujeme podle hmotnosti analyzované sloučeniny (S ≈ 0,25·MW^0,5 pro malé molekuly).
Bylo potvrzeno, že parametr k* má optimální rozsah 2–10. Vliv jednotlivých proměnných:
V příkladu byla původní metoda (5–95 % B/10 min; F=0,43 mL/min; Vm=0,45 mL) upravena na 5 min gradient při zachování k* = 2,15. Vypočtený Δφ = 44 % byl zaokrouhlen na 45 %, tj. rozmezí 50–95 % B/5 min, s minimálním dopadem na rozlišení.
Metoda založená na k* umožňuje:
Očekává se širší využití softwarových nástrojů a prediktivních modelů pro automatické přepočty metod mezi různými systémy a objemy mrtvého prostoru (dwell volume). Dále se rozvíjejí techniky micro- a nano-LC a aplikace umělé inteligence pro optimalizaci gradientních profilů.
Gradientní retenční faktor k* poskytuje univerzální nástroj pro normalizaci a přenos chromatografických metod. Umožňuje optimalizaci analytických podmínek, úsporu času i rozpouštědel a zajišťuje konzistentní rozlišení v různých konfiguracích HPLC.
HPLC
ZaměřeníVýrobceSouhrn
Význam tématu
Gradientní retence je klíčová pro separaci složitých směsí s širokým rozsahem polarity. Parametr k* (gradientní retenční faktor) umožňuje normalizovat podmínky a porovnávat různé chromatografické metody, optimalizovat dobu analýzy a snižovat spotřebu rozpouštědel při zachování požadované selektivity.
Cíle a přehled článku
Článek definuje gradientní retenční faktor k*, popisuje parametry ovlivňující jeho hodnotu a ukazuje, jak udržet konstantní k* při změně délky gradientu. Součástí je výpočetní příklad pro přizpůsobení metody z dlouhého 10min gradientu na kratší 5min provoz bez ztráty rozlišení.
Použitá metodika a instrumentace
Pro stanovení k* bylo využito gradientní vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) s C18 kolonnou 100×3,0 mm, 3 μm částicemi. Vrcholový tvar a retenční časy byly sledovány detektorem UV-Vis. Pro výpočet objemu prázdného prostoru kolony (Vm) byly použity rovnice:
- Vm = t0 × F (experimentální měření t0)
- Přibližné odhady Vm pomocí geometrických vzorců
Konstantu S odhadujeme podle hmotnosti analyzované sloučeniny (S ≈ 0,25·MW^0,5 pro malé molekuly).
Hlavní výsledky a diskuse
Bylo potvrzeno, že parametr k* má optimální rozsah 2–10. Vliv jednotlivých proměnných:
- Gradientní čas tG: delší gradient zvyšuje k* a průměrné rozlišení (Rs)
- Průtok F: mění retenci a šířku vrcholu
- Gradientní rozsah Δφ: musí být nastaven tak, aby vrcholy elutovaly v průběhu gradientu
- Objem kolony Vm a konstanta S: určují absolutní hodnotu k*
V příkladu byla původní metoda (5–95 % B/10 min; F=0,43 mL/min; Vm=0,45 mL) upravena na 5 min gradient při zachování k* = 2,15. Vypočtený Δφ = 44 % byl zaokrouhlen na 45 %, tj. rozmezí 50–95 % B/5 min, s minimálním dopadem na rozlišení.
Přínosy a praktické využití metody
Metoda založená na k* umožňuje:
- Rychlé přepočítání gradientních podmínek mezi různými kolonnami
- Úsporu organického rozpouštědla a zkrácení doby analýzy
- Udržení reprodukovatelné selektivity a porovnatelnosti výsledků
Budoucí trendy a možnosti využití
Očekává se širší využití softwarových nástrojů a prediktivních modelů pro automatické přepočty metod mezi různými systémy a objemy mrtvého prostoru (dwell volume). Dále se rozvíjejí techniky micro- a nano-LC a aplikace umělé inteligence pro optimalizaci gradientních profilů.
Závěr
Gradientní retenční faktor k* poskytuje univerzální nástroj pro normalizaci a přenos chromatografických metod. Umožňuje optimalizaci analytických podmínek, úsporu času i rozpouštědel a zajišťuje konzistentní rozlišení v různých konfiguracích HPLC.
Reference
- Back to Basics: Gradient Anatomy
- Back to Basics: Explaining Resolution
Podobná PDF
Back to Basics - Gradient Anatomy - Protocols for LC Instruments
2020||Technické články
Back to Basics Gradient Anatomy Protocols for LC Instruments 2020 Why is Gradient Chromatography Needed? Analytical samples are quite frequently made of complex analytes with varying physico-chemical properties, such as polarity. The analysis of these compounds using isocratic conditions could…
Klíčová slova
featherstone, featherstonecourt, courtmill, millroad, road𝑡𝐺, 𝑡𝐺gradient, gradientɸ𝑉𝑚𝑆, ɸ𝑉𝑚𝑆𝑃𝐶, 𝑃𝐶anatomy, anatomypitfalls, pitfallsretentivity, retentivityalters, altersbasics, basicschromatography, chromatographythings
Back to Basics - Dispersion - Protocols for LC Instruments
2020||Technické články
Back to Basics Dispersion Protocols for LC Instruments 2020 What is Dispersion? Dispersion is a measure of analyte band broadening between the injector and detector, excluding the contribution from the column. As a sample is injected into the flow path,…
Klíčová slova
dispersion, dispersionfeatherstone, featherstonecourt, courtmill, millroad, road𝑡𝑅, 𝑡𝑅zdv, zdv𝑆𝑦𝑠𝑡𝑒𝑚, 𝑆𝑦𝑠𝑡𝑒𝑚𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒, 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒volume, volumeunion, unionyield, yieldmeasured, measuredzero, zerodwell
Back to Basics - Explaining Resolution
2020||Technické články
Back to Basics Explaining Resolution 2020 What is Resolution? Chromatography is the act of separating components in a mixture. There are different measurements to determine the success of a separation, one of which is resolution (Rs). Resolution is determined between…
Klíčová slova
featherstone, featherstonecourt, courtmill, millroad, roadionisable, ionisable𝑅𝑠, 𝑅𝑠alter, altermodifier, modifierorganic, organicresolution, resolutioncan, canequation, equation𝑑𝑝, 𝑑𝑝different, differentresolved
Back to Basics - Pump Linearity and Dwell Volume Measurements - Protocols for LC Instruments
2020||Technické články
Back to Basics Pump Linearity and Dwell Volume Measurements Protocols for LC Instruments 2020 How is the Linearity of the Pump Measured? The linearity of the pump should be assessed between 0-100% using the conditions described in Figure 1. This…
Klíčová slova
featherstone, featherstonecourt, courtdwell, dwellmill, millroad, roadcorr, corrmau, mauwater, waterzdv, zdvvolume, volumepump, pumpabs, absamax, amaxlinearity, linearityproportionate
