Enhancing the Throughput and Robustness of DIA Using a 150 μm EASY-Spray Column

Zvýšení propustnosti a robustnosti DIA pomocí 150 µm EASY-Spray kolony

Význam tématu

Data Independent Analysis (DIA) představuje klíčovou technologii pro rozsáhlé a kvantitativní proteomické studie, protože umožňuje rychlou a přesnou identifikaci a kvantifikaci všech iontů v rámci LC-MS analýzy. Navýšení vzorkové propustnosti a robustnosti metodiky je zásadní pro průmyslové nasazení, klinické aplikace i rozsáhlé výzkumné projekty, kde jsou kritické časové a technické náklady.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon DIA získaný při tradičních nanoflow průtocích (300 nL/min) a při kapilárním průtoku (2 µL/min) s použitím 150 µm EASY-Spray kolony. Hodnoceny byly zejména: zvýšení počtu identifikovaných proteinů a peptidů za časovou jednotku, kvantitativní robustnost a limit detekce (LOQ) vybraných těžce značených peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla vytvořena komplexní směs tří proteomů (kvasinky, E. coli, HeLa) doplněná o 6×5 směs referenčních peptidů a iRT kalibranty. Spektrální knihovny vznikly z dat DDA na Q Exactive HF MS při nanoflow LC a následně byly analyzovány DIA běhy při různých gradientních délkách a objemech injekcí.

Instrumentace:

• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Q Exactive HF
• Nanoflow LC: EASY-nLC 1200 s 75 µm × 50 cm Acclaim PepMap C18 kolona
• Kapilární LC: Ultimate 3000 RSLCnano s prototypovou 150 µm × 15 cm Acclaim PepMap
• Analýza dat: Proteome Discoverer 2.1, Spectronaut 10, Skyline 3.6

Hlavní výsledky a diskuse

1. Propustnost: Při kapilárním průtoku a 30min gradientu bylo možné uskutečnit až 7 vzorků za den, což představuje více než 2,3× zkrácení analýzy oproti 1h nanoflow režimu.
2. Hloubka pokrytí: Na kapilární metodě bylo identifikováno průměrně 7 400 proteinů a 43 000 peptidů, zatímco nanoflow přineslo 9 600 proteinů a 70 000 peptidů při delších gradientech. Rozdíl v počtu byl pouze 15 % při výrazně vyšší propustnosti.
3. Citlivost: S 1 µl injekcí dosahovala kapilární metoda LOQ v řádu fmol/µl, u některých peptidů byla citlivost nižší o řád po navýšení objemu injekce na 4 µl.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zrychlení analýzy bez zásadního kompromisu v hloubce proteomické charakterizace.
• Kompatibilita s rutinními laboratorními podmínkami a vyšší robustnost oproti nanoflow nastavení.
• Možnost detekce nízkých hladin analýz s vhodným volením objemu injekce.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další optimalizace kapilárních kolen s ohledem na povrchovou chemii a délku, vývoj rychlejších gradientů a automatizovaných platforem pro vysoko propustné DIA. Integrace s AI-řízenou analýzou dat přinese další zrychlení zpracování a interpretace výsledků.

Závěr

Kapilární průtok s 150 µm EASY-Spray kolonou na Q Exactive HF umožňuje výrazné zvýšení propustnosti a udržení vysoké kvality identifikací a kvantifikací v DIA experimentech. Metoda nabízí atraktivní kompromis mezi rychlostí, robustností a citlivostí, vhodný pro průmyslové a klinické proteomické aplikace.

Reference

• MacLean B., et al. Bioinformatics. 2010 Apr 1;26(7):966–968.