The Power of Quantitative Multiplexing- Combining TMT discovery and targeted label free workflows for biomarker analysis

Význam tématu

Vysoká dynamika koncentrací proteinů v lidském plazmovém proteomu a potřeba přesného a citlivého vyhledávání a ověřování biomarkerů představují kritickou výzvu v klinické proteomice. Kombinace multiplexní isobarické kvantifikace pomocí Tandem Mass Tag (TMT) a rychlých label-free cílících metod s predikcí retenčních časů umožňuje zvýšit průchodnost analýz, zlepšit kvantitativní přesnost a zkrátit dobu potřebnou k validaci kandidátních biomarkerů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout a demonstrovat integrovaný pracovní tok pro biomarkerovou analýzu plazmy pacientů s diabetem, který kombinuje:

• Objevnou fázi s TMT6-plex kvantifikací a vysokopH frakcionací.
• Verifikační fázi s rychlou label-free PRM analýzou a predikcí retenčních časů pomocí SSRCalc.

Práce zahrnovala paralelní analýzu šesti biologických replik (3 normální, 3 diabetické), identifikaci diferencovaně exprimovaných proteinů a následnou cílenou kvantifikaci nejzajímavějších kandidátů.

Použitá metodika

• Příprava vzorků: deplece 12 abundatních proteinů z 20 µl plazmy, tryptická digesce, označení TMT6-plex činidly.
• Frakcionace: vysokopH reverzní fáze (Pierce High pH kit), osm frakcí.
• NanoLC separace: EASY-nLC 1200 s 50 cm Easy-Spray kolonkou, gradient 8–50 % ACN během 140 min, 300 nL/min.
• TMT Discovery: Orbitrap Fusion MS se synchronous precursor selection (SPS) MS3 kvantifikací.
• Label-free PRM: 1D LC na UltiMate 3000 (5 µL/min), Q Exactive HF-X ve full scan + PRM režimu s rozlišením 30 000.
• Retenční čas: kalibrace pomocí PRTC peptide standardu, predikce SSRCalc HI pro plánování eluce.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion (Thermo Scientific) – SPS MS3 analýza TMT vzorků.
• Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) – rychlá PRM analýza label-free vzorků.
• EASY-nLC 1200 a UltiMate 3000 (Thermo Scientific) pro nano a kapilární LC.

Hlavní výsledky a diskuse

• Objevná fáze: identifikováno 879 skupin proteinů a 12 865 unikátních peptidů; 95 % kvantifikovatelné napříč šesti vzorky.
• Volcano analýza odhalila 48 proteinů s p < 0,05 a log2 změnou > 0,5 mezi diabetickými a kontrolními skupinami (např. Talin, IGFBP-4, aktivátor HGF).
• SSRCalc predikce pro TMT a label-free kombinovala experimentální retenční časy PRTC standardů a umožnila přesné naplánování eluce neoznačených peptidů při kapilárním průtoku.
• Cílená PRM analýza ověřila 30 z 48 kandidátů během jediné hodiny na vzorek (throughput 24 vzorků/den) s konzistentní kvantitací vůči TMT objevné fázi.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená přesnost a reprodukovatelnost kvantifikace díky TMT multiplexování a SPS MS3.
• Rychlá a robustní verifikace kandidátů na neoznačených vzorcích bez nutnosti frakcionace.
• Predikce retenčních časů zkracuje dobu vývoje cílených metod a zlepšuje plánování instrumentálních běhů.
• Workflow je vhodný pro klinické studie s desítkami až stovkami vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zavádění ještě rychlejších Orbitrap analyzátorů s vyšší frekvencí skenování (> 40 Hz).
• Integrace strojového učení pro zpřesnění predikce retenčních časů a selekci biomarkerů.
• Rozšíření multiplexního kvantifikace na více kanálů (TMT10/16-plex) pro komplexnější studie.
• Aplikace workflow na další onemocnění a typy biologických vzorků (tkáně, buňky, biofluidy).

Závěr

Navržený pracovní tok efektivně kombinuje multiplexní TMT-based objevnou fázi s rychlou label-free PRM verifikací doplněnou o predikci retenčních časů. Tento přístup přináší vyváženou kombinaci citlivosti, přesnosti a vysoké průchodnosti, což usnadňuje identifikaci a validaci plazmových biomarkerů v klinických studiích.

Reference

• MacLean B. et al. Bioinformatics. 26(7):966-8.
• Renno W. et al. Medicina (Kannas). 42(2):147-63.
• Brismar K. et al. J Clin Endocrinol Metab. 79:872-8.
• Fafalios A. et al. Nature Med. 17(12):1577-84.
• Krokhin O. et al. Anal Chem. 81(22):9522-30.