Multiplexing SIMs on a Novel Benchtop Orbitrap MS with a Quadrupole Mass Filter to Increase Sensitivity for Peptide Quantitation

Význam tématu

Multiplexované vybraně iontové monitorování (SIM) na benchtop kvadrupól-Orbitrap hmotnostním spektrometru umožňuje významné zvýšení citlivosti a selektivity kvantifikace peptidů v biologických vzorcích. Tento přístup kombinuje robustnost kvadrupólových filtrů s vysokým rozlišením Orbitrapu, což napomáhá přesné analýze náročných biochemických matric.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit multiplexované SIM metody pro kvantifikaci inzulinu, exendinu-4 a GLP-1 v séru potkanů. Autoři se zaměřili na rozšíření dynamického rozsahu, zajištění opakovatelnosti měření a zkrácení doby analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Q Exactive (kvadrupól-Orbitrap) s multiplexovaným SIM.
• Ionizace: HESI, teplota 200 °C (heater), 275 °C (kapilára), 3,5 kV, AGC optimalizace pro každou analytu.
• Chromatografie: Thermo Scientific Accela UHPLC s kolonkou Hypersil GOLD 100 × 1 mm, 1,9 μm, průtok 150 μL/min, gradient 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě–acetonitrilu, doba analýzy 10 minut.
• SIM: multiplexované skenování izolačních oken šířky 20 amu, rozlišení Orbitrap 70 000 (max. 140 000 při m/z 200), automatická regulace zisku (AGC target).
• Software: Thermo Scientific LCQUAN verze 2.7 s nastavením hmotnostní tolerance 5 ppm.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala vysokou linearitu a reprodukovatelnost:

• Inzulin: dynamický rozsah 250 pg/mL až 1000 ng/mL, LOQ 250 pg/mL, R2 > 0,99, CV < 10 %.
• Exendin-4: rozsah 5 ng/mL až 10 μg/mL, LOQ 5 ng/mL, CV < 9 %.
• GLP-1: rozsah 0,1 ng/mL až 10 μg/mL, LOQ 0,1 ng/mL, R2 > 0,99, CV < 6 %.

Kalibrační křivky potvrdily lineární odezvu přes široký rozsah koncentrací a dobrou opakovatelnost měření.

Přínosy a praktické využití metody

Multiplexované SIM přináší rychlejší sběr dat napříč úzkými UHPLC píky, zvyšuje propustnost analýzy a zachovává vysokou citlivost. Metoda je vhodná pro biopharma výzkum, vývoj a QA/QC aplikace včetně monitorování peptidových léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření SIM multiplexování na další peptidy, malé proteiny a oligonukleotidy.
• Integrace s vysokopropustnými chromatografickými systémy a automatizace přípravy vzorků.
• Vylepšení algoritmů zpracování dat a zvýšení rozlišení pro komplexní biologické matice.

Závěr

Benchtop kvadrupól-Orbitrap s multiplexovaným SIM nabízí citlivou, selektivní a robustní platformu pro kvantitativní bioanalýzu peptidů. Díky rychlému sběru dat a širokému dynamickému rozsahu představuje atraktivní alternativu k tradičním triple kvadrupólovým systémům.

Reference

• Louis Maljers, Jonathan McNally, Rohan Thakur. Quantification of Insulin at Micro-Dosing Levels Using LC-MS/MS. Montreux LCMS Conference.
• Jonathan R. Kehler, Chester L. Bowen, Sharon L. Boram, Christopher A. Evans. Application of DBS for quantitative assessment of the peptide Exendin-4; comparison of plasma and DBS method by UHPLC-MS/MS. Drug Metabolism and Pharmacokinetics, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals.
• Oliver Lange et al. Multiple C-Trap Fills as a Tool for Massive Parallelization of Orbitrap Mass Spectrometry: A New Concept for Targeted Mass Analysis. ASMS Poster #103, 2011.