Proteomic Interrogation of Primary Insulin-secreting Pancreatic β-cells

Význam tématu

Proteomická analýza primárních inzulin-sekretujících β-buněk poskytuje hluboký molekulární vhled do procesů, které řídí jejich přežívání, funkci a odpověď na zánětlivý stres. Tento přístup otevírá nové cesty pro pochopení patofyziologie diabetu a identifikaci cílových drah pro onemocnění, u kterého jsou dosud dostupné terapie převážně symptomatické.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo využít výjimečné analytické schopnosti hmotnostního spektrometru Bruker timsTOF Pro s PASEF MS/MS k detailnímu popisu proteomu obohacených lidských β-buněk. Autoři usilovali o detekci i velmi nízko exprimovaných metabolických enzymů a ověření jejich funkční role v ochraně buněk před zánětlivou zátěží.

Použitá metodika a instrumentace

Primární lidské pankreatické ostrůvky získané od dárců byly enzymaticky disociovány a adenovirovou infekcí s promotérem RIP1 řízenou expresí fluorescenční bílkoviny ZsGreen označeny β-buňky. Po FACS třídění (>92% purity) následovalo standardní zpracování:

• Redukce a alkylace cysteinů, trypsinová štěpení
• Online 3D frakcionace peptidů: vysoké-pH RP, vysoké-pH SAX, nízké-pH RP
• UHPLC NanoAcquity (Waters) a integrovaný autosampler
• Hmotnostní spektrometr timsTOF Pro (Bruker) s PASEF® MS/MS akvizicí

Instrumentace:

• Aria II Cell Sorter (BD Biosciences)
• NanoAcquity UHPLC systém
• Bruker timsTOF Pro s iontovou mobilitou a PASEF

Hlavní výsledky a diskuse

Studie rozpoznala více než 5000 proteinů a poskytla kvantifikaci více než 3000 unikátních genových produktů s vysokou korelací oproti RNA-seq. Klíčové poznatky:

• Detekce nízkoho množství enzymů zapojených do ureagenese a metabolismu argininu.
• Potvrzení vysokého souladu mezi proteomickými a transkripčními daty pro vybrané metabolic­ké faktory.
• Identifikace pyruvát karboxylázy (PC) jako centrálního enzymu, který ve spolupráci s glukokinázou přesměrovává arginin ke tvorbě močoviny a chrání buňky před toxickým oxidem dusnatým vznikajícím za zánětlivých podmínek.

Přínosy a praktické využití metody

Metodika umožňuje:

• Detailní proteomické profilování omezeného počtu buněk
• Objev nových biomarkerů a terapeutických cílů pro diabetes
• Integrovanou studii funkčních drah propojujících zánět a metabolismus

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat:

• Rozšíření na další buněčné typy a modely onemocnění
• Integraci proteomiky s metabolomikou a transkriptomikou
• Cílenou validaci nových drah pro vývoj chorobě modifikujících terapií

Závěr

Implementace iontové mobility v kombinaci s PASEF MS/MS na instrumentu timsTOF Pro umožňuje bezprecedentní hloubku analýzy proteomu primárních β-buněk. Studie odhalila nové pro-survival metabolické dráhy a poskytla pevný základ pro vývoj inovativních postupů v léčbě diabetu.

Reference

1. Fu A., Alvarez-Perez J., Avizonis D., Kin T., Ficarro S.B., Choi D.W., ... Danial N.N. Glucose-dependent partitioning to urea cycle spares β-cells from inflammation. Nature Metabolism 2020;2:432–446.
2. Zhou F., Lu Y., Ficarro S.B., Adelmant G., Jiang W., Luckey C.J., Marto J.A. DEEP SEQ mass spectrometry: a platform for genome-scale proteome quantification. Nature Communications 2013;4:2171.
3. Askenazi M., Marto J.A., Linial M. The complete peptide dictionary – a meta-proteomics resource. Proteomics 2010;10:4306–4310.
4. Alexander W.M., Ficarro S.B., Adelmant G., Marto J.A. Multiplierz v2.0: a python-based ecosystem for shared access and analysis of native mass spectrometry data. Proteomics 2017;17:1700091.
5. Silva J.C., Gorenstein M.V., Li G.-Z., Vissers J.P.C., Geromanos S.J. Absolute quantification of proteins by LC–MSE. Molecular & Cellular Proteomics 2006;5:144–156.
6. Zhou F., Sikorski T.W., Ficarro S.B., Webber J.T., Marto J.A. An online nanoflow RP–SAX–RP LC–MS/MS platform for efficient and in-depth proteome sequence analysis of complex organisms. Analytical Chemistry 2011;83:6996–7005.
7. Ficarro S.B., Zhang Y., Alfonso M.C., Adelmant G.O., Garg B., Webber J.T., Luckey C.J., Marto J.A. Online nanoflow multidimensional fractionation strategies for high efficiency phosphopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics 2011;10:M111.011064.
8. Ficarro S.B., Zhang Y., Lu Y., Moghimi A.R., Askenazi M., Hyatt E., Smith E.D., Boyer L., Schlaeger T.M., Luckey C.J., Marto J.A. Improved electrospray ionization efficiency compensates for diminished chromatographic resolution and enables proteomics analysis of tyrosine signaling in embryonic stem cells. Analytical Chemistry 2009;81:3440–3447.