Customer Insights - Accelerating phosphoproteomics research with trapped ion mobility mass spectrometry (TIMS)

Význam tématu

Proteomika fosfoproteomů hraje klíčovou roli při odhalování buněčných signálních cest a post-translačních modifikací. Díky ní lze sledovat dynamiku fosforylace bílkovin, která ovlivňuje regulaci genové exprese, buněčnou proliferaci či apoptózu. Tradiční metodiky čelí výzvám v podobě nízké abundance fosfopeptidů, vysokého dynamického rozsahu a technické náročnosti separace izobarických a izomerických forem. TIMS přináší další, čtvrtý rozměr separace (iontová mobilita), čímž zlepšuje rozlišení, citlivost a propustnost při analýze komplexních vzorků.

Cíle a přehled studie

Laboratoř molekulární a buněčné bioanalýzy (MCBA) pod vedením Prof. Yasushi Ishihamy na Kyoto University společně s Brukerem implementovala technologii 4D-Proteomics na přístroji timsTOF Pro. Hlavním cílem je zvýšit rychlost, hloubku i reprodukovatelnost fosfoproteomických analýz a aplikovat je na klinické a výzkumné vzorky, včetně metaproteomických studií lidského mikrobiomu.

Použitá metodika a instrumentace

• Obohacení fosfopeptidů: IMAC, HAMMOC.
• Příprava vzorku: nanoLC-ESI kolony, StageTip mini-kolony, CDIT pro absolutní kvantifikaci.
• Separační techniky: ultravysokorozlišovací nano­kapilární LC s metr dlouhými kapilárami.
• Hmotnostní spektrometrie: timsTOF Pro (QTOF) s PASEF pro paralelní akumulaci a sériovou fragmentaci iontů.
• Analýza mobility: měření kolizního průřezu (CCS) v TIMS pro rozlišení konformací a izomerů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Díky 1minutovému gradientu a PASEF dosaženo propustnosti až 864 vzorků za den při nákladu <200 ng proteinu.
• Rozšířená hloubka průzkumu: vyčtení přes 70 % lidských proteinů jako fosforylovaných.
• Oddělení isobarických a pozičních izomerů fosfopeptidů.
• Profilování kináz a studie účinků inhibitorů kináz na fosfoproteom v rámci onkologického výzkumu.
• Klinické metaproteomické aplikace: analýza stolice z pacientů pro biomarkerové studie a vztahy lidského a bakteriálního proteomu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a opakovatelnost při nízkém množství vzorku.
• Zkrácení doby přípravy a analýzy, snížení provozních nákladů a údržby MS.
• Možnost sledovat dynamiku buněčných signálních drah a odpověď na lékové intervence.
• Využití v klinických studiích, farmacii, vývoji cílené terapie a objevování biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj přístupů založených na DIA pro eliminaci chybějících hodnot a lepší vhodnost pro výpočetní analýzy.
• Integrace proteomiky s genomikou a transkriptomikou (proteogenomika) pro přesnější charakterizaci patologií.
• Využití big data, strojového učení a bioinformatických nástrojů k mapování kompletních signálních sítí.
• Další zvyšování výkonnosti MS, optimalizace separace a selektivity obohacovacích postupů.

Závěr

TIMS-podporovaná 4D-Proteomics na Bruker timsTOF Pro přináší významný skok v rychlosti, hloubce a citlivosti fosfoproteomických analýz. To otevírá nové možnosti pro výzkum buněčných signálních procesů, klinické aplikace a objevování nových terapeutických cílů. Kombinace pokročilé analytické chemie a výkonné bioinformatiky umožňuje komplexní pohled na dynamiku fosforylace v biologických systémech.

Reference

1. Sugiyama N. a kol. Mol Syst Biol, 2008, 4:193.
2. Olsen JV. a kol. Sci Signal, 2010, 3(104):ra3.
3. Sharma K. a kol. Cell Reports, 2014, 8(5):1583–1594.
4. Glover MS. a kol. J Am Soc Mass Spectrom, 2018, 25(5):786–794.
5. Fernandez-Lima F. Int. J. Ion Mobil. Spec, 2016, 19:65–67.
6. Hu Y. a kol. J Med Chem, 2015, 58(1):30–40.
7. Wu P. a kol. Drug Discovery Today, 2016, 21(1):5–10.
8. Sugiyama N. a Ishihama Y. J Pharm Biomed Anal, 2016, 130:264–272.
9. Sugiyama N. a kol. Sci Rep, 2019, 9:10503.
10. Ang MY. a kol. Clin Chim Acta, 2019, 498:38–46.