MRMS powered single cell metabolomics – Quantification of picogram amounts of a biocatalytic product from few living cells

Význam tématu

Studium metabolického stavu jednotlivých mikrobiálních buněk je zásadní pro pochopení heterogenity buněčných populací a optimalizaci biotechnologických procesů. Kvantifikace nízkomolekulárních metabolitů v extrémně malých vzorcích vyžaduje techniky s vysokou citlivostí a rozlišením.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout analytický postup kombinující neinvazivní mikrofluidní kultivaci vybraných bakterií Corynebacterium glutamicum s přímou infuzní hmotnostní spektrometrií se solariX XR FT-ICR-MS (DI-MRMS). Studie demonstruje možnost měření produkce L-lysinu z desítek živých buněk v objemu pouhých mikrolitrů.

Použitá metodika a instrumentace

• Mikrofluidní Envirostat čip pro kontinuální kultivaci a zachytávání buněk pomocí dielektroforézy.
• Přímá infuze nanoESI (TriVersa NanoMate, Advion) do FT-ICR-MS solariX XR (12 T) v CASI režimu m/z 147 ± 2,5 Da.
• NanoLC systém (Ultimate 3000 nanoRSLC, Thermo Fischer) s nanoViper vedením a PEEK adaptér pro přesný 1,5 µL injekt.
• Kultivační médium 20 mM amonný uhličitan s 500 mM glukózou a eluent 1:1 voda-metanol s 0,1 % formiové kyseliny.
• Interní standard 15N2-L-lysine pro kompenzaci denní variability.

Hlavní výsledky a diskuse

Kombinace mikrofluidního odběru a DI-MRMS umožnila detekovat a kvantifikovat L-lysine produkovaný 19 až 21 buňkami během dvou hodin kultivace. Optimalizace délky transiantu (3,5 s) a akumulační doby (1,6 s) vedla k maximálnímu poměru signálu a šumu. Metoda dosáhla meze detekce 0,5 ng/mL (1,1 pg) a meze kvantifikace 1,1 ng/mL při celkové době analýzy 6,5 min.

Přínosy a praktické využití metody

• Analýza vzorků ≤1,5 µL bez ztráty analytu a bez desolvatace.
• Ultravysoce rozlišené FT-ICR-MS (R > 1 000 000) pro oddělení isobarických interferencí.
• Nástroj pro sledování specifické produktivity biokatalytických procesů na úrovni jednotlivých buněk.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se aplikace pro další nízkomolekulární metabolity úpravou CASI oken a využití mikrofluidních platforem pro multiplexní analýzu. Integrace s pokročilou mikroskopií a automatizovanou manipulací rozšíří možnosti single cell metabolomiky.

Závěr

Vyvinutý workflow spojuje mikrofluidní kultivaci a DI-MRMS, což umožňuje vysoce citlivou kvantifikaci biokatalytických produktů z desítek živých buněk. Metoda představuje průlom pro studium buněčné heterogenity a optimalizaci biotechnologických procesů v mikro a nanoškále.

Reference

1. Dusny C, Lohse M, Reemtsma T, Schmid A, Lechtenfeld OJ. Quantifying a Biocatalytic Product from a Few Living Microbial Cells Using Microfluidic Cultivation Coupled to FT-ICR-MS. Anal Chem. 2019;91(11):7012–7018.
2. Rosenthal K, Falke F, Frick O, Dusny C, Schmid A. Micromachines. 2015;6(12):1836–1855.