A Fully Automated Robotic Set-Up based on Ultrahigh-Resolution QTOF Mass Spectrometry for Hydrogen Exchange Experiments

Význam tématu

Hydrogen exchange mass spectrometry (HX-MS) umožňuje detailní analýzu přístupnosti amidek zpětného vazebního řetězce proteinů a sledování jejich konformačních změn. Tato metoda je zásadní pro mapování epitopů terapeutických protilátek, studium protein-proteinových interakcí a kontrolu kvality biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout plně automatizované robotické řešení pro HX-MS experimenty, které zajistí přesné časování, vysokou citlivost a opakovatelnost. Jako modelový systém byl použit E. coli Hsp90 (HtpG) s a bez ATP, přičemž se sledovaly dynamické změny v několika časových bodech značení.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Plně automatizovanou přípravu vzorků (preinkubace, deuterace, záchyt reakcí, peptidová štěpení) řízenou robotem HDX PAL3 (LEAP Technologies) a softwarem Chronos (Axel Semrau).
• Ultra-vysoko-výkonnou kapalinovou chromatografii na UHPLC 1290 Infinity II (Agilent) při nízkých teplotách (0,5–8 °C).
• Detekci peptidů na ultra-vysoko-rozlišovacím QTOF spektrometru maXis II (Bruker Daltonics).
• Analýzu dat v HDExaminer (Sierra Analytics) s generováním křivek příjmu deuteria a heat map; vizualizaci konformačních změn v PyMol (Schrödinger).

Hlavní výsledky a diskuse

• Po pepsinovém štěpení bylo identifikováno 179 peptidů, z nichž po ruční kuraci a vyloučení redundancí zůstalo 47 peptidů pokrývajících 95 % sekvence HtpG.
• Přidání ATP vedlo k významnému zvýšení ochrany amidek v N-terminálním ATP-navázacím doméně, projevující se ve zpomaleném deuterovém výměnném chování (slow-exchange tensed state).
• Byl pozorován EX1 mechanismus výměny vodík–deuteriem, indikující koexistenci dvou konformačních populací v důsledku pomalé hydrolytického štěpení ATP a přechodu do flexibilnějšího, beznukleotidového stavu.
• Robotický protokol zkrátil dobu experimentu přibližně o 135 min oproti sekvenčním měřením a zajistil vynikající reprodukovatelnost, což dokládají malé odchylky v křivkách příjmu deuteria.

Přínosy a praktické využití metody

• Plná automatizace eliminuje lidskou chybu a zajišťuje přesné časové rozlišení každého kroku značení.
• Ultra-vysoké rozlišení a věrnost izotopových vzorců umožňují spolehlivou kvantifikaci i při komplikovaných případech (koelutující peptidy, EX1 kinetika).
• Metoda je vhodná pro rutinní epitope mapping, studium protein-proteinových interakcí a kvalitativní kontrolu biologických léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých algoritmů strojového učení pro optimalizaci plánování a analýzy dat.
• Minaturizace a paralelizace robotických výměn pro vysokopropustné screeningové aplikace.
• Rozšíření na studium komplexnějších biomakromolekulárních systémů a membrane proteinů.

Závěr

Vyvinutý plně automatizovaný robotický systém založený na UHR-QTOF MS pro HX-MS experimente poskytuje přesné časování, vysokou citlivost a vynikající izotopovou věrnost. Výsledky jsou srovnatelné či lepší než u manuálních postupů a metoda výrazně zvyšuje efektivitu a reprodukovatelnost strukturovýzkumných studií.

Reference

• Graf C., Mayer M.P. et al. Conformational cycle of Hsp90. EMBO Journal. 2009;28:602–613.