In-Solution Protein Digestion for Proteomic Samples

Význam tématu

Proteolytické štěpení proteinů je základní přípravný krok v proteomické analýze, který umožňuje identifikaci a kvantifikaci peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie. Standardizovaný a reprodukovatelný proces minimalizuje technickou variabilitu a zvyšuje spolehlivost výsledků, což je klíčové pro akademický výzkum i průmyslovou kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného postupu je nabídnout kompletní řešení pro in-solution štěpení proteinů, zahrnující všechny potřebné reagencie v rámci jednoho soupravového systému. Protokol je optimalizován pro vzorky o celkovém obsahu proteinů 35–350 µg, přičemž klade důraz na jednoduchost, opakovatelnost a možnost automatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Postup tvoří osm hlavních kroků:

1. Příprava vzorku: 5 µl vzorku obsahujícího 35–350 µg proteinu.
2. Denaturace: přidání 30 µl Digestion Bufferu (0,1 M TRIS pH 8, 4 mM CaCl₂) a 2,5 µl N-oktyl-glukosidu.
3. Redukce: 5 µl redukčního činidla (50 mM tris-(2-karboxyethyl)-fosfinu), krátká inkubace a centrifugace.
4. Alkylace: 2,5 µl methyl-methan-tiosulfonátu, 10 minut při pokojové teplotě.
5. Ředění: doplnění 50 µl Digestion Bufferu pro optimální podmínky pro trypsin.
6. Štěpení: 10 µl roztoku trypsinu (rozpuštěného v 0,1 % kyselině mravenčí), inkubace 3 hodiny při 37 °C (možnost úpravy poměru trypsin/protein 1:10 až 1:20).
7. Centrifugace po inkubaci pro sběr kondenzátu.
8. Ukončení reakce: 5 µl 10% kyseliny mravenčí (uživatelský dodaný roztok).

Instrumentace:

• SCIEX Protein Preparation Kit (SCIEX P/N 4445247)
• TPCK-ošetřený trypsin (SCIEX P/N 4445250)

Hlavní výsledky a diskuse

Použití kompletního soupravového řešení zajišťuje vysokou opakovatelnost a robustnost štěpení. Časové a objemové parametry jsou optimalizované pro široké spektrum proteinových vzorků. Centrifugační kroky po každé inkubaci minimalizují ztráty vzorku a zlepšují přesnost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá implementace v rutinních laboratořích i v automatizovaných systémech.
• Minimalizace variability mezi vzorky díky jednotným činidlům a podmínkám.
• Flexibilita v nastavení poměru trypsin/protein podle množství vzorku.
• Úspora času a snížení počtu pipetovacích kroků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace proteolytického štěpení přechází na robotické platformy a mikrofluidní systémy, což umožní další snížení spotřeby vzorku a činidel. Vývoj rychlejších a specifikovanějších proteáz nebo modulárních enzymových reaktorů může dále zkrátit dobu přípravy vzorků a zvýšit hloubku proteomické analýzy. Integrace s novými technikami hmotnostní spektrometrie a bioinformatickými nástroji podpoří vyšší throughput a citlivost analýzy.

Závěr

Navržený protokol založený na SCIEX Protein Preparation Kit představuje spolehlivý a efektivní způsob in-solution štěpení proteinů pro proteomické aplikace. Díky standardizovanému složení činidel a optimalizovaným postupům nabízí vysokou reprodukovatelnost, snadnou automatizaci a široké možnosti přizpůsobení dle specifických potřeb laboratoře.

Reference

1. SCIEX Protein Preparation Kit, část č. 4445247 a TPCK-ošetřený trypsin, část č. 4445250
2. SCIEX (2017) Application Note k automatizaci proteolytického štěpení, dokument č. RUO-MKT-02-5438-A