Impact on Glycan profile caused by media components as a critical quality attributes on in-house produced mAb

Význam tématu

Glykanový profil monoklonálních protilátek (mAb) je klíčovým kvalitativním atributem ovlivňujícím biologickou aktivitu, dobu působení v krvi a schopnost vyvolat imunitní odpověď. Regulátoři definují přijatelná rozmezí modifikací, jako jsou vysokomannózové oligosacharidy, afukosylace nebo galaktosylace. Úprava média pomocí vitamínů nabízí možnost cílené modulace glykozylace při výrobě terapeutických protilátek.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vyhodnocení vlivu šesti různých vitamínů přidávaných v odlišných koncentracích na glykanový profil vnitropodně vyráběného trastuzumabu. Pomocí návrhu experimentu (DOE) bylo provedeno 17 různých kultivačních podmínek, včetně kontrolního vzorku (originální šarže trastuzumabu) a standardu glykanové směsi.

Použitá metodika a instrumentace

U vzorků s koncentrací 50 µg proteinu v 50 mM HEPES pH 7,9 byl N-glykan uvolněn enzymem PNGase F. Uvolněné oligosacharidy byly značeny reaktivem InstantPC umožňujícím detekci pomocí fluorescence i hmotnostní spektrometrie. Separace proběhla na HILIC kolonce pomocí UPLC Agilent 1290 Infinity II spojené s Agilent 6546 LC/Q-TOF. Relativní plocha špiček pro jednotlivé glykoformy byla vyhodnocena softwarově.

Hlavní výsledky a diskuse

Vzorky s vyššími dávkami vitamínů vykázaly významné změny v obsahu vysokomannózových forem (HM%), zejména Man5, oproti originálu. Galaktosylace (Gal%) mohla dosahovat až 40 %, zatímco afukosylované a třikrát galaktosylované formy (AF%, TAF%) zůstaly v souladu s referenční šarží. Návrhový profil (prediction profile) ukázal, že až 50 % variability glykanového profilu lze vysvětlit změnou vitaminových komponent média.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost cílené úpravy media za účelem optimalizace kritických kvalitativních atributů mAb.
• Zvýšení galaktosylace pro lepší CDC aktivitu.
• Využití DOE přístupu pro efektivní screening a optimalizaci složení média.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšířený screening dalších živin a doplňků média pro jemné ladění glykozylace.
• Integrace omických dat a pokročilých prediktivních modelů pro predikci glykanového profilu.
• Nasazení inline monitoringu glykanů v reálném čase při výrobě mAb.
• Adaptace metodiky pro vývoj biosimilars a biobetter protilátek.

Závěr

Studie prokázala, že suplementace vitamínů v kultivačním médiu výrazně ovlivňuje výskyt vysokomannózových a galaktosylovaných forem u trastuzumabu. Tento přístup umožňuje řídit kritické atributy glykozylace a přispívá k optimalizaci výroby terapeutických protilátek.

Reference

• Morelle, W. A. et al. Rapid Mass Spectrometric Strategy for the Characterization of N‐and O‐glycan Chains in the Diagnosis of Defects in Glycan Biosynthesis. Anal. Chem. 2009, 81 (11), 1800–1813.
• Batra, J.; Rathore, A. S. Glycosylation of Monoclonal Antibody Products: Biotechnology Progress 2016, 32 (5), 1091–1102.