Unambiguous di-sulphide bond assignment in synthetic peptides Linaclotide and Plecanatide using Agilent 6546/6550 LC-QTOF High Resolution Mass Spectrometer

Význam tématu

Di-sulfidové vazby hrají klíčovou roli ve formování sekundární struktury a biologické aktivity peptidů a proteinů. U malých cysteinových peptidů, jako jsou Linaclotide a Plecanatide, je jednoznačné přiřazení vazeb složité vzhledem k těsné prostorové poloze thiolových skupin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo přesně identifikovat všechny di-sulfidové mosty v syntetických peptidech Linaclotidu (3 mosty) a Plecanatidu (2 mosty) a vyvinout robustní analytický postup založený na postupné redukci, cyanylaci, frakcionaci a hmotnostní spektrometrii vysokého rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická metodika zahrnovala:

• Částečnou redukci di-sulfidových vazeb pomocí TCEP s optimalizovaným poměrem peptid:TCEP
• Cyanylaci uvolněných thiolových skupin CDAP
• Frakcionaci cyanylovaných peptidů na HPLC s ručními sběry frakcí po UV detekci
• Štěpení při inkubaci v 1 M NH₃ a 6 M Gdn-HCl při 25 °C
• Analýzu vzorků na platformě Agilent 6546/6550 LC-QTOF spojeném s Agilent 1290 Infinity II HPLC
• Potvrzení sekvence fragmentů prostřednictvím MS/MS dat

Instrumentace

Agilent 6546 a 6550 LC-QTOF High Resolution Mass Spectrometer s Agilent 1290 Infinity II HPLC systémem.

Hlavní výsledky a diskuse

Linaclotide:

• Potvrzeny tři di-sulfidové vazby Cys1–Cys6, Cys2–Cys10 a Cys5–Cys13.
• Postupná redukce zvýšila molekulární hmotnost o 2 Da na jeden uvolněný most. Cyanylací se hmotnost navýšila o 50 Da.
• MS/MS fragmentace specifických peptidů potvrdila očekávanou sekvenci fragmentů.

Plecanatide:

• Optimalizovanou redukcí identifikovány vazby Cys4–Cys12 a Cys7–Cys15.
• Deconvoluovaná spektra a MS/MS data potvrdily jedinečné fragmenty pro každou vazbu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a jednoznačnou kontrolu di-sulfidové topologie peptidů v rámci QA/QC, minimalizaci chyb v syntéze a rozšíření na analýzu dalších cysteinových spojení v biotechnologiích a farmacii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace datového zpracování a integrace do platformy pro kontinuální monitoring kvality.
• Zlepšení selektivity redukčních kroků a rozšíření metodiky na větší proteiny a konjugáty.
• Komercializace a zavedení do rutinního provozu ve farmaceutických a výzkumných laboratořích.

Závěr

Studie prokázala spolehlivost kombinované metodiky částečné redukce, cyanylaci, frakcionace a LC-QTOF MS/MS pro přesné určení di-sulfidových vazeb v Linaclotidu a Plecanatidu. Přístup nabízí vysokou citlivost, specifičnost a využitelnost v kontrolách kvality peptidové syntézy.

Reference

1. Góngora-Benítez M., Tulla-Puche J., Paradís-Bas M., Werbitzky O., Giraud M., Albericio F. Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-rich peptide linaclotide. Biopolymers. 2011;96(1):69–80. doi:10.1002/bip.21480.