Screening and Quantitation of Amino Acids and Other Nutrients In Spent Media

Význam tématu

Analýza složení opotřebovaných média z fermentačních procesů je klíčová pro optimalizaci výživy buněčných kultur, efektivní recyklaci živin a porozumění metabolickým změnám během růstu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout rychlou a citlivou metodu pro screening a kvantifikaci 24 klíčových živin v opotřebovaných médiích s použitím Agilent 1290 Infinity II LC systému spojeného s Ultivo LC/TQ MS.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnovala následující kroky a vybavení:

• Vzorky opotřebovaného média byly ředěny až do 100násobné ředící řady s 1% kyselinou mravčí v 50:50 ACN/H2O.
• Na separaci aminokyselin a vitaminu B byl použit Agilent AdvanceBio MS Spent Media column (2.1×100 mm).
• UHPLC podmínky: mobilní fáze A – 20 mM acetát amonný s 0.1% formiátovou kyselinou; mobilní fáze B – 20 mM acetát amonný v 90% ACN; gradient 100→40→100 % B během 20 minut; průtok 300 µl/min; teplota kolony 25 °C; injekce 10 µl.
• Mass spektrometrický systém Ultivo LC/TQ využil Agilent Jet Stream ionizaci, 20 psi nebulizační tlak, sušicí plyn 12 l/min při 150 °C, plášťový plyn 12 l/min při 390 °C, kapilární napětí ±2000 V, MRM režim ve dvou polaritách.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila chromatografické rozlišení 21 aminokyselin a 3 vitamínů skupiny B během 20 minut. Kvantifikace proběhla v rozsahu 1 ppb až 1 ppm s LOQ mezi 1 až 20 ppb a korelačními koeficienty R2 od 0.993 do 0.999. Sledování dynamiky koncentrací v opotřebovaném médiu ukázalo proměnlivou spotřebu živin během 10 dní kultivace. Výsledky reprezentovaly změny abundance pomocí TIC profilu a MRM chromatogramů.

Přínosy a praktické využití metody

• Dosažení vysoké analytické citlivosti na úrovni nízkých ppb bez nutnosti derivatizace.
• Rychlá separace a kompletní analýza 24 živin v jednom běhu.
• Minimální příprava vzorku a úspora času v rutině QA/QC a výzkumu fermentací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit o další malé polaritní metabolity, automatizovat přípravu vzorků a aplikovat ve vysokoprůtokových platformách. Dále je možné integrovat s metabolomickými daty pro komplexní sledování buněčného metabolismu.

Závěr

Navržená LC/TQ metoda s použitím AdvanceBio MS Spent Media kolony poskytuje spolehlivou, rychlou a citlivou platformu pro kvantifikaci klíčových živin v opotřebovaných médiích, což podporuje výzkum a optimalizaci fermentačních procesů.

Reference

1. Agilent AdvancedBio workflows for spent media analysis; Agilent Publication No 5991-8817EN
2. Agilent AdvanceBio MS Spent Media Column, User Guide; Agilent Publication No 820120-015