A Clinical Research Method for the Measurement of Low- Level Testosterone in Serum using Differential Mobility Separation with LC-MS/MS

Význam tématu

Citlivé stanovení nízkých hladin testosteronu v lidském séru je zásadní pro správnou diagnostiku endokrinních poruch, sledování terapeutické účinnosti a výzkum hormonálních profilů. Tradiční imunochemické metody často podléhají křížové reaktivitě a interferencím endogenních látek, což omezuje jejich přesnost při velmi nízkých koncentracích.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl vyvinout klinicky použitelnou metodu kombinující Differential Mobility Separation s LC-MS/MS, která odstraní izobarické interferující složky, zjednoduší přípravu vzorku a zkrátí dobu chromatografické analýzy při zachování vysoké citlivosti.

Použitá metodika

Vzorky lidského séra byly připraveny jednorázovou kapalně-kapalnou extrakcí. K 200 µl séra byl přidán interní standard a extrakční směs hexan–ethylacetát 90:10, vzorek byl vířen, centrifugován a organická fáze vysušena pod dusíkem. Suchý zbytek byl rekonstituován v metanolu a vodě. Separace probíhala na systému SCIEX ExionLC s kolonkou C18 (100×2,1 mm, 2,6 µm) při průtoku 0,6 ml/min v gradientu vody s fluoridem amonným a methanolu během 7 minut. Differential Mobility Separation SelexION+ filtrovávala izobarické rušivé ionty při nastaveném separačním napětí 3700 V a kompenzačním napětí 8,9 V. Detekce probíhala na SCIEX Triple Quad 6500+ v režimu multiple reaction monitoring s elektrosprejovou ionizací.

Použitá instrumentace

• SCIEX ExionLC HPLC systém
• Phenomenex Kinetex C18 kolonka (100×2,1 mm, 2,6 µm)
• SelexION+ Differential Mobility Separation buňka
• SCIEX Triple Quad 6500+ s IonDrive Turbo V zdrojem

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla limitu kvantifikace pod 1 pg/ml, což umožňuje měření celkového i volného testosteronu. Lineární odezva byla potvrzena v rozsahu 0,1–100 pg/ml. Porovnání citlivosti s a bez použití DMS prokázalo zachování nebo zlepšení poměru signál šum, přestože absolutní počet iontů byl nižší. Analýza reálných sér ukázala výrazně snížené pozadí a efektivní odstranění interferujících komponent.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá LC-DMS-MS/MS metoda nabízí vysokou specifičnost a citlivost bez kompromisů v dolní meze kvantifikace, zjednodušenou přípravu vzorků a zkrácenou dobu analýzy. Je vhodná pro klinickou diagnostiku endokrinních onemocnění, monitorování hormonálních terapií a výzkumné aplikace zaměřené na nízké hladiny steroidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření použití diferenciální pohyblivosti iontů pro další klinicky významné steroidy a metabolity. Další vývoj může zahrnovat automatizaci přípravy vzorků, miniaturizaci a integraci do multi-analyzních panelů v klinických laboratořích, stejně jako aplikace v personalizované medicíně.

Závěr

Prezentovaná LC-DMS-MS/MS metoda umožňuje spolehlivé stanovení nízkých hladin testosteronu v séru s vysokou specifičností a citlivostí. Eliminace izobarických interferencí a zefektivněná příprava vzorků odemykají nové možnosti v klinické diagnostice a výzkumu.

Reference

1. Jarvis M, Blake D. A Clinical Research Method for the Measurement of Low-Level Testosterone in Serum using Differential Mobility Separation with LC-MS/MS. SCIEX Application Note. 2020.