Improving targeted peptide quantification - Combining a TSQ Altis with a FAIMS Pro interface for peptides in complex matrices

Význam tématu

Moderní kvantitativní analýza peptidů v komplexních biologických matricích vyžaduje maximální selektivitu a citlivost. Tradiční LC-MS/MS metody založené na triple kvadrupólu často narážejí na limit kvantifikace vlivem chemického pozadí a koelutujících rušivých látek. Integrace diferenciální mobilitní spektrometrie FAIMS Pro umožňuje potlačit interferující ionty v plynné fázi a výrazně zlepšit poměr signál-šum, dynamický rozsah a LOQ peptidů.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři demonstrují kombinaci FAIMS Pro rozhraní s nano-LC EASY-nLC 1200 a TSQ Altis triple kvadrupólem pro cílenou kvantifikaci peptidů v komplexních směsích. Cílem je prokázat zlepšení signál-šum, rozšíření dynamického rozsahu a snížení LOQ na modelových standardech PRTC, angiotenzinu I a systému 7 x 5 mixu ve striktně kontrolovaných experimentálních podmínkách.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol zahrnoval enzymatický digest vzorků HeLa a plazmy, do kterých byly přidány izotopově značené peptidové standardy. Klíčová instrumentace:

• Chromatografie nano-flow EASY-nLC 1200 se 40minutovým gradientem a kolonkou EASY-Spray
• Diferenciální iontová mobilita FAIMS Pro v normálním rozlišení bez přídavného plynu
• Detekce SRM na TSQ Altis triple kvadrupólu s optimalizovanými CV hodnotami pro jednotlivé prekurzory
• Analýza dat v TraceFinder softwaru

Optimalizace kompenzačního napětí probíhala buď v řadě injekcí s hodnotami v 10 V krocích nebo globálně po vyhodnocení celkového CV rozsahu. SRM přechody byly nastaveny na 4 až 5 fragmentů peptidu.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace FAIMS Pro přinesla zásadní potlačení chemického pozadí a zvýšení signál-šum u nízkých koncentrací:

• Peptid HVLTSIGEK detekovatelný až od 25 attomol na kolonce jen s FAIMS Pro, bez něj byl pod úrovní šumu
• Angiotenzin I v digested plazmě zachytitelný na 70 attomol pouze při využití FAIMS Pro
• System Suitability Test mix 7 x 5 prokázal lineární odezvu a RSD absolutních ploch pod 15 % v celém rozsahu 0,13 až 200 fmol
• 40násobná injekce angiotenzinu I prokázala robustnost systému s RSD pod 10 % bez nutnosti čištění FAIMS elektrod
• Diferenciace isomerických peptidů pomocí odlišných CV hodnot potlačila intermolekulární interferenci až dvacetinásobně

Přínosy a praktické využití metody

Nasazení FAIMS Pro spolu s TSQ Altis triple kvadrupólem nabízí:

• Výrazné zlepšení limitu kvantifikace v aplikacích LC-MS/MS bioanalýzy regulatorních studií
• Spolehlivé oddělení koelutujících a izobarických interferencí
• Vysokou opakovatelnost výsledků bez nárůstu údržby vstupních částí spektrometru
• Možnost rychlé optimalizace CV pro malé panelové sledy i rozsáhlé multiplexované metody

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj této technologie lze očekávat v oblasti klinické proteomiky, analýzy biomarkerů s ultra nízkými koncentracemi a ve farmaceutickém výzkumu PKPD. Integrace FAIMS s vysokým rozlišením hmotnostních analyzátorů a strojovým učením pro predikci CV hodnot otevře cestu k automatizovaným, vysoce propustným kvantitativním workflow.

Závěr

Kombinace FAIMS Pro interface s TSQ Altis triple kvadrupólem prokazuje významné zlepšení selektivity a citlivosti v cílené peptidové kvantifikaci. Metoda snižuje pozadí, zvyšuje dynamický rozsah a zlepšuje LOQ i robustnost při opakovaných analýzách komplexních matric.

Reference

1. Kolakowski BM et al Review of applications of high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry FAIMS and differential mobility spectrometry DMS Analyst 2007 132 842 864
2. Bonneil E et al Enhancement of mass spectrometry performance for proteomic analyses using FAIMS J Mass Spectrom 2015 50 1181 1195
3. Swearingen KE et al High-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry for mass spectrometry-based proteomics Expert Rev Proteomics 2012 9 505 517