Quantification of Steroids in Human Plasma by Liquid Chromatography Coupled with the Affordable Q Exactive Focus HRMS

Význam tématu

Steroidní hormony jsou nízkomolekulární metabolity syntetizované z cholesterolu, které řídí řadu fyziologických procesů včetně metabolismu, imunitní odpovědi a reprodukce. Jejich koncentrace v krvi se pohybují v rozsahu nanomolárních až pikomolárních hodnot, což klade nároky na vysoce selektivní a citlivé analytické metody. Imunochemické testy mohou trpět zkreslením a omezenou vhodností pro pediatrické či ženské vzorky, zatímco LC-HRMS nabízí vyšší selektivitu, možnost retrospektivní analýzy a sledování více metabolitů najednou.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout robustní LC-HRMS metodu pro rutinní kvantifikaci osmi klíčových steroidů v lidské plazmě.
• Ověřit výkon cenově dostupného přístroje Thermo Scientific Q Exactive Focus HRMS pro klinický výzkum s požadavky na vysokou citlivost a přesnost.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém: Rheos Allegro pumpa a CTC PAL autosampler.
• Kolona: Thermo Scientific Accucore C18 (2.1 × 50 mm, 2.6 μm) při 60 °C.
• MS detektor: Thermo Scientific Q Exactive Focus HRMS se zdrojem HESI II.

Použitá metodika

• Příprava vzorku: 100 μL plazmy, doplnění interními standardy, SPE extrakce (mixed mode cation), sušení dusíkem a reekstrakce do H2O/MeOH (50:50).
• Chromatografie: gradient 10 %→75 %→100 % MeOH s 50 μL/L formic acid, průtok 600 μL/min, injekce 40 μL.
• MS podmínky: pozitivní režim, full scan m/z 200–400, rozlišení 70 000 FWHM, spray voltage 4000 V, kapilární teplota 380 °C.
• Cílený SIM režim pro testosteron: středové m/z 290, okno 8 m/z, C-trap kapacita 5×10^5 nábojů, max. inj. čas 100 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení osmi steroidů a jejich izomerů bylo dosaženo do 14 minut.
• Kalibrace i QC splňovaly kritéria přesnosti a přesnosti ≤15 % pro kalibrátory a ≤20 % pro LLOQ.
• LLOQ pro testosteron v plazmě 100 μL činilo 0,125 nM (1,45 pg na koloně) s variabilitou ≤21 %.
• Srovnání literaturních dat prokazuje, že citlivost Q Exactive Focus HRMS je srovnatelná s triple kvadrupólovými přístroji.
• SIM režim zvýšil LOD, ale LLOQ zůstalo nezměněno.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje rutinní klinický výzkum a kontrolu kvality steroidních analýz.
• Full scan data umožňují retrospektivní screening dalších metabolitů bez nutnosti opakovaných injekcí.
• Metoda kombinuje rychlou separaci, vysokou selektivitu a dostatečnou senzititu pro nízké koncentrace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace ESI parametrů (teploty, plyny) pro další zvýšení citlivosti.
• Zvýšení objemu vzorku (200–400 μL) pro dosažení nižších LLOQ.
• Rozšíření panelu steroidů a jejich metabolitů pro komplexní endokrinní profil.
• Využití full scan a HRMS/MS dat pro metabolomické a screeningové studie neznámých látek.

Závěr

Prezentovaná LC-HRMS metoda na Q Exactive Focus MS je rychlá, robustní a dostatečně citlivá pro kvantifikaci osmi steroidů v lidské plazmě. Přístroj nabízí výkon srovnatelný s triple kvadrupólovými systémy a navíc umožňuje efektivní rozlišení izomerů a retrospektivní analýzu.

Reference

1. Ketha H., Kaur S., Grebe S.K., Singh R.J. Clinical applications of LC-MS sex steroid assays: evolution of methodologies in the 21st century. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2014;21:217–226.
2. Greaves R.F., Jevalikar G., Hewitt J.K., Zacharin M.R. A guide to understanding the steroid pathway: new insights and diagnostic implications. Clin Biochem. 2014;47:5–15.
3. Rochat B., Kottelat E., McMullen J. The future key role of LC-high-resolution-MS analyses in clinical laboratories: a focus on quantification. Bioanalysis. 2012;4:2939–2958.
4. Ke Y., Bertin J., Gonthier R., Simard J.N., Labrie F. A sensitive, simple and robust LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of seven androgen- and estrogen-related steroids in postmenopausal serum. J Steroid Biochem Mol Biol. 2014;144:523–534.
5. Koren L., Ng E.S., Soma K.K., Wynne-Edwards K.E. Sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for multiple steroids in mammalian and avian circulation. PLoS One. 2012;7:e32490.
6. Søeborg T., Frederiksen H., Fruekilde P., Johannsen T.H., Juul A., Andersson A.M. Serum concentrations of DHEA, DHEAS, 17α-hydroxyprogesterone, Δ4-androstenedione and testosterone in children determined by TurboFlow-LC-MS/MS. Clin Chim Acta. 2013;419:95–101.
7. Salameh W.A., Redor-Goldman M.M., Clarke N.J., Reitz R.E., Caulfield M.P. Validation of a total testosterone assay using high-turbulence liquid chromatography tandem mass spectrometry: total and free testosterone reference ranges. Steroids. 2010;75:169–175.
8. Han J., Zhang S., Liu W., Leng G., Sun K., Li Y., Di X. An analytical strategy to characterize the pharmacokinetics and pharmacodynamics of triptorelin in rats based on simultaneous LC-MS/MS analysis of triptorelin and endogenous testosterone in rat plasma. Anal Bioanal Chem. 2014;406:2457–2465.
9. Rhea J.M., French D., Molinaro R.J. Direct total and free testosterone measurement by liquid chromatography tandem mass spectrometry across two different platforms. Clin Biochem. 2013;46:656–664.
10. Wang Y., Gay G.D., Botelho J.C., Caudill S.P., Vesper H.W. Total testosterone quantitative measurement in serum by LC-MS/MS. Clin Chim Acta. 2014;436:263–267.
11. Büttler R.M., Martens F., Kushnir M.M., Ackermans M.T., Blankenstein M.A., Heijboer A.C. Simultaneous measurement of testosterone, androstenedione and dehydroepiandrosterone (DHEA) in serum and plasma using Isotope-Dilution 2-Dimension Ultra High Performance Liquid-Chromatography Tandem Mass Spectrometry (ID-LC-MS/MS). Clin Chim Acta. 2015;438:157–159.
12. Koal T., Schmiederer D., Pham-Tuan H., Röhring C., Rauh M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile-analysis. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012;129:129–138.
13. Keski-Rahkonen P., Huhtinen K., Poutanen M., Auriola S. Fast and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry assay for seven androgenic and progestagenic steroids in human serum. J Steroid Biochem Mol Biol. 2011;127:396–404.
14. Kyriakopoulou L., Yazdanpanah M., Colantonio D.A., Chan M.K., Daly C.H., Adeli K. A sensitive and rapid mass spectrometric method for the simultaneous measurement of eight steroid hormones and CALIPER pediatric reference intervals. Clin Biochem. 2013;46:642–651.