Metabolomic Profiling in Drug Discovery: Understanding the Factors that Influence a Metabolomics Study and Strategies to Reduce Biochemical and Chemical Noise

Význam tématu

Metabolomické profilování se v oblasti vývoje léčiv využívá ke sledování biochemických změn vznikajících v organismu po podání kandidátních sloučenin. Identifikace metabolických markerů toxicity či účinnosti významně urychluje preklinický výzkum a umožňuje optimalizovat klinické studie. Pro spolehlivou detekci markerů je však nutné potlačit chemický i biologický „šum“, který může skrýt drobné, ale relevantní změny v metabolickém profilu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo navrhnout automatizovaný pracovní postup a využít moderní instrumentaci pro redukci chemického a biologického pozadí v LC-MS metabolomických studiích. Autoři představili aplikaci vysokorozlišovacího Orbitrapového hmotnostního analyzátoru Q Exactive Focus ve spojení s UHPLC separací a pokročilým softwarem SIEVE pro detekci a kvantifikaci metabolitů v séru potkanů s různým časem půstu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků bylo ze séra odstraněno bílkovinové pozadí příměsí ledově studeného methanolu s kyselinou mravenčí. Vzorky byly vysušeny a rekonstituovány v 90:10 (H2O/methanol) s interním standardem N-benzoyl-D5-glycinem.

Použitá instrumentace

• UHPLC Thermo Scientific Open Accela 1250 se sloupcem Hypersil GOLD aQ (150 × 2,1 mm, částice 1,9 μm), teplota 50 °C, průtok 600 μl/min.
• Gradient: 0–6 min z 100 % A (0,1 % HCOOH ve vodě) na 20 % A, 6–8 min na 40 % A, 8–12 min na 5 % A, 12–17 min re-ekvilibrace na 100 % A.
• Mass spectrometer Q Exactive Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap, rozlišení 70 000 FWHM, sběr dat v pozitivním i negativním režimu.
• Software Thermo Scientific SIEVE s algoritmem Component Extraction pro hromadné zpracování a redukci šumu.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza hromadných dat v režimu Component Extraction umožnila snížit datový objem o odfiltrování redundancí a chemického pozadí. V sériích QC vzorků bylo dosaženo opakovatelnosti < 2 % RSD oblasti píků interního standardu během 35 hodin od externí kalibrace. Rozlišení 70 000 umožnilo rozlišit izotopické složky (34S vs. 13C2) a přesně určit elementární složení. PCA model jasně oddělil kontrolní skupinu krmených potkanů od vzorků s 2, 4, 8, 12 a 16 hodinami půstu. Mezi významně regulované metabolity patřily například methionin (nárůst s délkou půstu), arachidonová mastná kyselina či lyso-fosfatidylcholiny (pokles). Data ukázala, že biologická variabilita (vliv půstu, stáří zvířat) je hlavní zdroj šumu a je třeba ji cíleně mapovat.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká stabilita a přesnost hmotnostních měření bez nutnosti technických replikátů.
• Redukce chemického pozadí a redundancí vedoucí k rychlejší a spolehlivější statistické analýze.
• Možnost externí kalibrace udržet výkon analýzy až 35 hodin.
• Uplatnění v toxikologii a farmakokinetice pro detekci biomarkerů účinnosti či toxicity.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj další generace rychlých Orbitrap analyzátorů a AI-říděných algoritmů zpracování dat umožní ještě efektivnější odstraňování šumu a automatizovanou anotaci metabolitů. Integrace metabolomiky s multi­omickými daty (proteomika, lipidomika) a využití strojového učení pro predikci farmakologických účinků povede ke komplexnějšímu obrazu biochemických drah a snížení doby vývoje nových léčiv.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace UHPLC-Orbitrapové platformy Q Exactive Focus s inteligentním softwarovým zpracováním dat výrazně zlepšuje kvalitu metabolomických profilů. Klíčovou roli hraje kontrola biologické variability (např. půst zvířat) a potlačení chemického pozadí. Tento přístup poskytuje robustní základnu pro objev biomarkerů v preklinickém vývoji léčiv.

Reference

• Sanders M., Hnatyshyn S., Robertson D. et al. Metabolomic Profiling in Drug Discovery. Application Note 610, Thermo Fisher Scientific, 2016.