Mass Spectral Effects from Using Ammonium Bicarbonate for Protein IEX-MS

Význam tématu

Ion-exchange chromatografie (IEX) v přímé hyphenaci s hmotnostní spektrometrií (MS) nabízí cenné informace o struktuře a modifikacích nativních proteinů, zejména monoklonálních protilátek. Správný výběr mobilních fází je klíčový pro spolehlivou identifikaci, zachování nativního stavu a přesné hmotnostní stanovení bez zbytečných artefaktů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na posouzení vlivu (bi)uhličitanových mobilních fází, konkrétně amonného uhličitanu, na průběh IEX–MS analýz proteinů. Cílem bylo vyhodnotit dopady na chromatografii, hmotnostní spektra a integritu proteinů a navrhnout optimální alternativu pro nativní analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Byl použit BioAccord LC–MS systém vybaven BioResolve™ SCX-mAb kolonkou a pH koncentráty IonHance™ CX-MS. Mobilní fáze A i B obsahovaly 10–75 mM amonného acetátu s pH 5,0–8,7, do fáze B byla přidávána 5–20 mM amonného uhličitanu. Detekce probíhala současně UV při 280 nm a elektrosprayskou hmotnostní spektrometrií s ESI zdrojem.

Hlavní výsledky a diskuse

• Mismatch chromatogramů: (Bi)uhličitanové fáze způsobují nesoulad mezi TIC a UV 280 nm stopou, což znesnadňuje spolehlivou identifikaci elujících proteinů.
• Supercharging a denaturace: Již při nízkých koncentracích 5 mM bylo pozorováno zvýšení nábojových stavů a částečná denaturace proteinů v ESI dropletách.
• Vznik CO₂ aduktů: Dekonvoluční analýza odhalila +44 Da posuny, indikující tvorbu CO₂ komplexů na proteinových subjednotkách.
• Širší dekonvoluované píky: (Bi)uhličitanové metody vykazovaly horší rozlišení a redukovanou schopnost odhalit nízkoabundantní proteoformy, například glykosylace u mAb.

Přínosy a praktické využití metody

Alternativa s amonným acetátem a IonHance CX-MS pH koncentráty poskytuje:

• Reprodukovatelné chromatogramy se souběžným UV a MS signálem.
• Zachování nativního stavu proteinů bez superchargingu a denaturace.
• Čistší hmotnostní spektra bez aduktů CO₂ a lepší rozlišení proteoform.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další výzkum může směřovat k:

• Využití alternativních pufrů s optimalizovaným pKa profilem pro rozšíření rozsahu pH.
• Integraci high-resolution MS přístrojů pro detailní charakterizaci proteoform.
• Vývoji softwaru pro automatizovanou korekci aduktů a superchargingových artefaktů.

Závěr

Doporučenou praxí pro nativní IEX–MS analýzu proteinů je zcela vyloučit (bi)uhličitanové mobilní fáze a preferovat amonný acetát s IonHance CX-MS koncentráty. Tento přístup zajišťuje konzistentní chromatografii, jasné hmotnostní spektra a věrné zachování struktury proteinů.

Reference

1. Leblanc Y. et al. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2017, 1048:130–139.
2. Bailey A.O. et al. mAbs. 2018, 10(8):1214–1225.
3. Fussl F. et al. MAbs. 2019, 11(1):116–128.
4. Yan Y. et al. Anal. Chem. 2018, 90(21):13013–13020.
5. Konermann L. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2017, 28(9):1827–1835.
6. Hedges J.B. et al. Anal. Chem. 2013, 85(13):6469–6476.
7. Cassou C.A. et al. Anal. Chem. 2013, 85(1):138–146.
8. Sterling H.J. et al. Anal. Chem. 2012, 84(8):3795–3801.