Simultaneous Analysis of Chiral Amino Acids Produced by Intestinal Microbiota using LC/MS/MS

Význam tématu

Intestinální mikrobiota vytváří různé metabolity, mezi nimi D-amino kyseliny, které mohou ovlivňovat fyziologii hostitele a podílet se na vývoji onemocnění. Jejich kvantifikace a rozlišení od běžných L-izomerů je zásadní pro pochopení role těchto molekul v biochemických a patologických procesech.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a citlivou metodu založenou na LC-MS/MS pro současnou analýzu D- a L-aminokyselin v biologických vzorcích bez nutnosti derivatizace. Metoda byla aplikována na zkoumání myších kolických obsahů a krevní plazmy u germ-free (GF) a Ex-GF myší s normální mikrobiotou.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii bylo použito UHPLC Nexera X2 s kolonou CROWNPAK CR-I (3×150 mm, 5 μm). Mobilní fáze: acetonitril/ethanol/voda/trifluoroctová kyselina (80/15/5/0,5), průtok 0,6 mL/min, teplota kolony 25 °C, objem injekce 1 μL.
Hmotnostní spektrometrie probíhala na LCMS-8060 v režimu ESI pozitivní ionizace, s následujícími parametry:

• proud nebulizačního plynu 3,0 L/min,
• proud sušícího plynu 15,0 L/min,
• proud topného plynu 5,0 L/min,
• teplota rozhraní 250 °C,
• teplota DL 250 °C,
• teplota blokového topení 300 °C.

Vzorky kolického obsahu byly extrahovány v pufru PBS, homogenizovány, centrifugovány a filtrované na ultrafiltračním membráně (MW 5000) s následnou koncentrační filtrací a rozpuštěním v mobilní fázi. Krevní plazma byla deproteinována acetonitrilem, extrahována chloroformem/vodou, centrifugována, ultrafiltrována a zkoncentrována.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy MRM potvrdily dostatečné rozlišení D- a L-izomerů. V kolických obsazích Ex-GF myší bylo detekováno 14 druhů D-aminokyselin oproti 7 u GF myší. Koncentrace 12 D-aminokyselin (např. alanin, serin, glutamát, fenylalanin) byly statisticky významně vyšší v Ex-GF skupině, což dokládá produkci mikrobiotou. V plazmě Ex-GF myší bylo nalezeno 6 D-aminokyselin vs. 3 u GF myší, přičemž hladiny D-alaninu výrazně překračovaly ty u germ-free jedinců, což naznačuje přenos mikrobiálních metabolitů do krevního oběhu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou (analytický čas <4 min), vysoce citlivou a bezderivatizační kvantifikaci D- a L-aminokyselin v komplexních biologických matricích. Je ideální pro výzkum mikrobiálních metabolitů, studií fyziologických funkcí D-aminokyselin a monitorování biomarkerů onemocnění.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s multi-omics přístupy k prozkoumání interakcí mezi mikrobiotou a hostitelem.
• Rozšíření na další chiralní metabolity a peptidy.
• Využití v klinických studiích pro identifikaci nových biomarkerů neurologických a metabolických onemocnění.
• Automation a vysokoprodukční analýza pro rutiní laboratorní aplikace.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s použitím balíčku pro D/L-aminokyseliny a bez derivatizace nabízí rychlou, citlivou a komplexní analýzu chiralních aminokyselin v biologických vzorcích. Otevírá nové možnosti pro základní i aplikovaný výzkum fyziologických rolí D-aminokyselin a jejich využití v prevenci a diagnostice onemocnění.

Reference

• M. Matsumoto, A. Kunisawa, T. Hattori, S. Kawana, Y. Kitada, H. Tamada, S. Kawano, Y. Hayakawa, J. Iida, E. Fukusaki, Scientific Reports 8, 17915 (2018).
• Y. Nakano, Y. Konya, M. Taniguchi, E. Fukusaki, Journal of Bioscience and Bioengineering 123, 134–138 (2017).