AUTOMATED HIGH-THROUGHPUT N-GLYCAN PREPARATION WORKFLOW ON A COMMERCIALLY AVAILABLE BENCHTOP PIPETTING ROBOT

Význam tématu

Příprava N-glykanů je nezbytná pro analýzu glykosylace proteinů, která ovlivňuje kvalitu biologických léčiv, diagnostiku onemocnění a základní výzkum. Automatizace zvyšuje reproducibilitu, snižuje chyby obsluhy a zkracuje čas přípravy vzorku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo implementovat a hodnotit end-to-end workflow pro preparaci N-glykanů metodou RapiFluor-MS na automatizované platformě Andrew+. Studie porovnává manuální a automatizované zpracování vzorků z hlediska doby, reproducibility a efektivity značení.

Použitá metodika

Workflow zahrnuje několik kroků: denaturaci vzorku, enzymatickou digestici, odběr N-glykanů, značení RapiFluor-MS činidlem a konečnou purifikaci. Reakce probíhají v mikrotitračních destičkách s kontrolou teploty a časování přes OneLab software. Použití 8-kanálových pipet zvýšilo throughput a snížilo dobu pipetování.

Použitá instrumentace

• Andrew+ pipetovací robot (Andrew Alliance) s automatizovanými kanály Sartorius (1-kanálový a 8-kanálový režim)
• OneLab software pro navrhování a řízení protokolů
• UHPLC systém ACQUITY Glycan BEH Amide, 1.7 μm, 130 Å, 2.1×150 mm
• ACQUITY FLR detektor (excitační λ=265 nm, emisní λ=425 nm)
• Reakční destičky a 1,5 mL mikrozkumavky pro reagencie RapiFluor-MS

Hlavní výsledky a diskuse

Analytické metody ukázaly vysokou reprodukovatelnost retenčních časů i ploch píků u čtyř hlavních glykoforem. Srovnání automatizované a manuální přípravy (N=12) prokázalo srovnatelnou kvalitu značení s tendencí k vyšší výtěžnosti u automatizace. Relativní odchylky (RSD) pro retenční časy, plošné a relativní plošné hodnoty byly obdobné, což potvrzuje spolehlivost automatického postupu.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby přípravy vzorku (dvojnásobné zrychlení díky 8-kanálovým pipetám)
• Redukce variability a lidských chyb
• Snadná replikace protokolu mezi laboratořemi prostřednictvím OneLab platformy
• Vylepšená efektivita značení N-glykanů pro kvantitativní a kvalitativní analýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace přípravy vzorků se dále rozšiřuje o vyspělé robotické systémy s modulárními stanicemi pro čištění, stanovení a integraci s MS. Integrace umělé inteligence pro optimalizaci protokolů či predikci podmínek může dále zvýšit efektivitu. V budoucnu lze workflow rozšířit na jiné derivatizační metody nebo multiplexní analýzy glykanů.

Závěr

Automatizovaný GlycoWorks RFMS protokol na platformě Andrew+ poskytuje rychlé, reprodukovatelné a vysoce efektivní řešení pro přípravu N-glykanů. Výsledky prokázaly, že automatizace minimalizuje chyby obsluhy a zvyšuje výtěžnost značení bez kompromisů v kvalitě analýzy.