Pretreatment Procedure Handbook for Metabolites Analysis

Význam tématu

Metabolomická analýza pomocí hmotnostní spektrometrie (GC-MS/MS, LC-MS/MS) nachází uplatnění v medicíně, farmacii i potravinářství. Zajišťuje kvantifikaci klíčových nízkomolekulárních metabolitů spojených s energetickými drahami i signálními molekulami. Rozvoj robustních a citlivých předúprav výrazně zvyšuje kvalitu dat a spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Publikace popisuje podrobný protokol pretreatmentu krví séra pro GC-MS i LC-MS analýzu primárních metabolitů. Cílem je zavést univerzální postup umožňující extrakci hydrofilních i hydrofobních složek, derivatizaci (pro GC-MS) a filtraci (pro LC-MS), následovanou vysoce výkonnou analýzou s metodickými balíčky a databázemi „Smart Metabolites Database“ a „Method Package Ver. 2“.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow GC-MS:

• Deproteinizace: voda–methanol–chloroform (1:2,5:1), odstředění a separace vodné fáze
• Sušení: rotační evaporace methanolu, lyofilizace
• Derivatizace: methoxyaminace v pyridinu, následná TMS derivatizace (MSTFA)

Workflow LC-MS:

• Deproteinizace obdobně jako pro GC-MS
• Size-exclusion filtrace k odstranění zbývajících proteinů
• Evaporace a lyofilizace, redissoluce ve vodě před analýzou

Klíčová instrumentace Shimadzu:

• GCMS-TQ8040 (Smart Metabolites Database, MRM/Scan režimy)
• GCMS-QP2020 (Smart SIM, GCMS Insight)
• LCMS-8040/8045/8050 (PFPP columna, Method Package Ver. 2)
• LCMS-8060 (UF-Technologies, vysoká citlivost a rychlost analýzy)

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání scan vs. MRM režimu pro GC-MS/MS ukázalo zlepšení tvaru a citlivosti špiček v MRM. V LC-MS s Method Package Ver. 2 bylo možné simultánně kvantifikovat až 97 primárních metabolit (aminokyseliny, organické kyseliny, nukleotidy) bez nutnosti individuální optimalizace metod. Smart MRM automatizoval návrh metod a AART korekci retence zkrátila dobu přípravy dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální předúprava séra vhodná pro široké spektrum oborů (biomedicína, průmysl, výživa)
• Automatizace tvorby MRM/SIM metod zkracuje čas nastavení a minimalizuje chyby
• Vysoká citlivost a robustnost UF-ion source (LCMS-8060) umožňuje analýzu stopových koncentrací
• Databázová podpora Smart Metabolites Database usnadňuje neznámé metabolity detekovat a identifikovat

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření pokrytí metabolitů zapojených do lipidomiky a signaling pathways
• Integrace s omickými technikami (proteomika, lipidomika) pro holistické pohledy
• Využití AI a strojového učení pro automatické zpracování a interpretaci metabolomických dat
• Miniaturizace a multiplexace pro klinické high-throughput screeningy

Závěr

Popsané protokoly předúprav spolu s moderními hmotnostními spektrometry a softwarovými balíčky umožňují přesné, citlivé a výkonné metabolomické analýzy krevních vzorků i dalších biologických matric. Automatizace a databázová podpora dramaticky zkracují dobu přípravy a zvyšují kvalitu výsledků.

Reference

• Ikeda A, Nishiumi S, Shinohara M, et al. Serum metabolomics as a novel diagnostic approach for gastrointestinal cancer. Biomed Chromatogr. 2012;26(5):548–558. doi:10.1002/bmc.1671
• Ogura T, Bamba T, Fukusaki E. Development of a practical metabolite identification technique for non-targeted metabolomics. J Chromatogr A. 2013;1301:73–79. doi:10.1016/j.chroma.2013.05.054