Automated high-throughput proteomic analysis of stored blood cells from a large cohort of non-domestic felids

Význam tématu

Analýza proteomu červených krvinek z neodomácněných kočkovitých šelem je klíčová pro bezpečné krevní transfúze v zoo a záchranných centrech. Neznalost krevních skupin těchto druhů a nestabilita vzorků při dlouhodobém skladování komplikuje plánování urgentních zákroků. Automatizované vysokopropustné proteomické metody umožňují rychlé a standardizované vyhodnocení proteinového složení i po týdnech uchovávání.

Cíle a přehled studie

Studie sledovala proteomické změny v červených krvinkách 136 jedinců z 18 druhů neodomácněných koček po skladování krve 0, 7, 14 a 28 dní při transfuzní teplotě (4 °C) a následném mražení. Hlavním cílem bylo ověřit stabilitu proteinového obsahu a vyvinout workflow pro analýzu velkých šarží vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

• Skladování vzorků: odebraná krev, odstředění červených krvinek po 0–28 dnech skladování při 4 °C, následné zmražení při −80 °C.
• Automatizované zpracování: platforma AccelerOme pro lýzu, odstranění DNA, redukci, alkylaci, digesci trypsinem/lysC a čištění peptideů.
• LC-MS/MS analýza: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC, kolona EASY-Spray 2 µm C18 (150 µm×15 cm), gradient 13 min + 3 min ekvilibrace, průtok 2–2,5 µL min⁻¹, teplota 50 °C, injekce 200 ng.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Astral v režimu DIA (199 oken 3 m/z, rozsah 380–980 m/z), MS1 sken co 0,6 s (240 000 rozlišení, AGC 5 × 10⁶, max. injekční čas 3 ms).
• Správa a zpracování dat: platforma Ardia propojená s Xcalibur 4.7 pro automatické odesílání, Proteome Discoverer 3.1 s algoritmem CHIMERYS 2.7.9, UniProt databáze Feliformia, funkce Match Between Runs, multikonsensus.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzou 1 072 běhů LC-MS bylo identifikováno přes 53 000 peptidů a více než 7 000 proteinových skupin. Na vzorek připadalo průměrně přes 10 000 peptidů a cca 1 500 proteinů. Citlivost metody a počet identifikací zůstaly stabilní při skladování až 28 dní. Proteinové signály pokryly více než sedm řádů dynamického rozsahu. Princip komponentní analýza ukázala jasné shlukování vzorků podle druhu, odpovídající fylogenetickým vztahům.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizovaná automatizace minimalizuje chyby obsluhy a zkracuje dobu přípravy vzorků.
• Vysokopropustný režim (100 vzorků/den) je vhodný pro velké kohortní studie a urgentní klinické aplikace.
• Data management přes Ardia a CHIMERYS zajišťuje okamžité zpracování bez nutnosti cloudového řešení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na hmotnostní multiplexní kvantifikaci (TMT) pro detailní porovnání stavů.
• Vytváření referenčních knihoven krevních proteinů exotických druhů pro rychlou diagnostiku.
• Integrace real-time monitoringu stability vzorků během dlouhodobého skladování.
• Adaptace metody na další taxony divokých zvířat a divočinu.

Závěr

Platforma kombinující AccelerOme, Vanquish Neo, Orbitrap Astral a Ardia s CHIMERYS představuje robustní řešení pro vysokopropustnou proteomiku červených krvinek. Stabilita identifikací při skladování až 28 dní umožňuje efektivní přípravu transfuzního materiálu pro neodomácněné kočky a podporuje rychlé rozhodování v zoo medicíně.

Reference

• UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase.