Automated high-throughput proteomic analysis of stored blood cells from a large cohort of non-domestic felids

Význam tématu

Krevní transfúze představují životně důležitou léčbu u anemických zvířat, avšak u ne-domestikovaných kočkovitých jsou dostupné informace o krevních typech omezené, což zvyšuje riziko závažných komplikací. Dlouhodobé skladování a možnost přesné shody dárců a příjemců jsou klíčové pro veterinární medicínu v zoologických zahradách.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit automatizovaný vysokopropustný proteomický protokol pro analýzu skladovaných červených krvinek od 136 jedinců 18 ne-domestikovaných druhů kočkovitých. Studie sledovala vliv skladování (0, 7, 14 a 28 dní) na proteomický profil a biologickou konzistenci dat.

Použitá metodika a instrumentace

Analýza zahrnovala následující kroky:

• Odběr a skladování krve v transfúzní chladničce (0–28 dní) a následné zmražení červených krvinek při –80 °C.
• Automatizovaná příprava vzorků na platformě Thermo Scientific AccelerOme: lyze, odstranění DNA, redukce, alkylace, enzymatická štěpení (Trypsin/LysC) a čištění peptidů bez uživatelské intervence.
• Vysoce propustná kapilární UHPLC (Thermo Scientific Vanquish Neo s kolonkou EASY-Spray C18, 150 mm) spojená s Orbitrap Astral hmotnostním spektrometrem v režimu DIA (199 x 3 m/z oken, m/z 380–980, MS1 rozlišení 240 000, AGC 5 × 10^6).
• Systém řízení a sběru dat: Xcalibur 4.7; správa a vzdálené monitorování: Ardia platforma.
• Automatizované zpracování dat: Proteome Discoverer 3.1 SP1 s algoritmem CHIMERYS 2.0, vyhledávání v databázi UniProt Feliformia.

Hlavní výsledky a diskuse

• Bylo dokončeno 1072 injekcí; identifikováno více než 53 000 peptidů a přes 7000 proteinů.
• Průměrně 10 000 peptidů a cca 1500 proteinů na vzorek, dynamický rozsah signálu přes 7 řádů.
• PCA analýza ukázala jasné shlukování vzorků podle druhu, odpovídající fylogenetickým vztahům.
• Citlivost měření zůstala stabilní po 16 dnech skladování, což potvrzuje robustnost workflow.
• Databázová redundance naznačuje možnou nadhodnocenou úroveň skupin proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované workflow minimalizuje manuální kroky, zvyšuje reprodukovatelnost a propustnost. Výsledky umožňují detailní charakterizaci proteomu červených krvinek a představují základ pro diagnostiku kompatibility při transfuzích ne-domestikovaných kočkovitých.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší využití proteomiky ve veterinární transfuzní medicíně a výzkumu krevních biomarkerů.
• Integrace pokročilých databází a strojového učení pro automatizované klasifikace vzorků.
• Cloudové a edge computing řešení pro vzdálené laboratorní sítě v zoologických zahradách.
• Přechod k jedno-buněčné proteomice a širší spektrum molekulárních analýz.

Závěr

Automatizovaný vysokopropustný proteomický protokol založený na platformách AccelerOme, Vanquish Neo a Orbitrap Astral poskytuje stabilní, reprodukovatelné a detailní výsledky analýzy skladovaných červených krvinek ne-domestikovaných kočkovitých. Workflow zjednodušuje sběr, zpracování a interpretaci dat, čímž podporuje pokročilý výzkum a klinickou praxi.

Reference

• Schauer K.L., Yang K., Hakimi A.M., Damoc E., Parkinson L.A.B. Automated high-throughput proteomic analysis of stored blood cells from a large cohort of non-domestic felids. Thermo Fisher Scientific, 2024.