High-Throughput Proteomic Analysis of Stored Red Blood Cells from Non-Domestic Cat Species

Význam tématu

Transfuze krve představuje život zachraňující postup u zvířat anemických v důsledku traumatu nebo nemoci.
U druhů volně žijících koček je riziko komplikací vysoké kvůli nedostatečným znalostem krevních skupin a kompatibility.
Doporučeno je charakterizovat proteom erytrocytů pro optimalizaci skladování krve a plánování transfuze mezi různými druhy.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vyhodnocení změn v proteomu uskladněných erytrocytů u 36 jedinců 18 druhů ne-domácích koček akreditovaných institucích AZA v USA.
Vzorky byly uchovávány 0, 7, 14 a 28 dní při 4 °C a následně při -80 °C až do analýzy.
Cílem bylo vyvinout vysokoprůchodovou, standardizovanou metodu pro hloubkovou analýzu proteomu erytrocytů.

Metodika

Shromažďování vzorků:

• Odběr krve od 36 jedinců 18 různých druhů.
• Uskladnění erytrocytů ve transfuzní chladničce (0, 7, 14, 28 dní).

Příprava vzorků:

• Automatizovaná platforma AccelerOme™ pro lýzu, odstraňování DNA, redukci, alkylaci, trypsinovou digesci a čistění peptidů.

Analytická metoda:

• Kapilární LC-MS/MS s Orbitrap Exploris™ 480 a FAIMS Pro.
• Datově závislá akvizice (DDA) s rozlišením 60K pro MS1, AGC 3e6, injekční čas 25 ms.
• 26minutový gradient, průtok 1,5 µl/min, EASY-Spray™ PepMap C18 (2 µm, 150 µm × 15 cm).

Použitá instrumentace

• AccelerOme™ automatizovaná platforma pro přípravu vzorků.
• UltiMate™ 3000 RSLCnano s EASY-Spray™ PepMap C18 (2 µm, 150 µm × 15 cm).
• Orbitrap Exploris™ 480 s rozhraním FAIMS Pro™.

Hlavní výsledky a diskuse

Díky vysoké automatizaci a rychlému LC-MS/MS bylo možné analyzovat ~55 vzorků/den.
Průměrně identifikováno více než 2000 peptidů na vzorek a ~500 proteinových skupin.
Málo neúplných štěpení (missed cleavages) a vysoká reprodukovatelnost dat.
Dominance hemoglobinu v proteomu erytrocytů, přesto dostatečné hloubkové pokrytí.
Vyhledávání probíhalo v databázi UniProtKB podřádu Feliformia s využitím SEQUEST, INFERYS a Percolator.

Přínosy a praktické využití metody

Standardizovaný, hands‐off workflow minimalizuje chyby obsluhy a zkracuje dobu přípravy.
Vysoká propustnost vhodná pro klinické aplikace a urgentní transfuzní scénáře v zoologických zahradách.
Široké využití pro křížové testování kompatibility a dlouhodobé skladování krve.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace isobarického značení (TMT11plex, TMTpro 16plex) pro srovnávací kvantifikaci.
Optimalizace metod pro hlubší proteomické pokrytí a rozšíření na další ne-domácí druhy.
Vývoj standardizovaných databází pro přesnější identifikaci proteinů u volně žijících zvířat.
Možnost implementace v monitorování kvality krve během skladování v reálném čase.

Závěr

Popsaná metoda poskytuje robustní, reprodukovatelný a rychlý přístup k proteomické analýze erytrocytů ne-domácích koček.
Umožňuje detailní charakterizaci proteomu, která může zvýšit bezpečnost a efektivitu transfuzních postupů v zoologických zahradách.

Reference

• Hakimi A, Schauer KL, Reeber SL, Bahten K, Kim W, Lopez Ferrer D, Parkinson LAB. High-Throughput Proteomic Analysis of Stored Red Blood Cells from Non-Domestic Cat Species. Thermo Fisher Scientific; 2021.