Disulfide Bond Identification of Biotherapeutic Proteins Using Various Fragmentation Techniques Available on an Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Disulfidické můstky hrají klíčovou roli ve struktuře a funkci bioterapeutických proteinů, zejména monoklonálních protilátek a fúzních proteinů. Jejich správná konektivita zajišťuje biologickou aktivitu a stabilitu, zatímco nesprávné nebo „scrambled“ vazby mohou vést k nežádoucím vlastnostem a snížené účinnosti produktu. Regulátoři vyžadují detailní mapování disulfidů jako součást charakterizace léčiva.

Cíle a přehled studie

Tato studie se zaměřila na identifikaci disulfidických vazeb v bioterapeutickém proteinu Etanercept pomocí různých fragmentačních technik na hmotnostním spektrometru Orbitrap Fusion Tribrid. Cílem bylo:

• Ověřit správné disulfidické vazby v CDR3 doméně
• Detekovat případné volné nebo přeskupené (scrambled) cysteiny
• Zmapovat variabilní N-terminální proteoformy

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Deglykozylaci: PNGase F a neuraminidáza při 37 °C, pH 8, 3 h
• Denaturaci: guanidin HCl s N-ethylmaleimidem (NEM) při pH 5, 37 °C, 3 h (blokace volných cysteinů)
• Trypsinizaci: 0,1 M Tris-HCl, 37 °C přes noc
• Redukce aliquoty digestu: DTT pro kontrolu sníženého vzorku

Instrumentace:

• UHPLC Vanquish s kolonou Accucore C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm)
• Gradient: 0–80 % B (0,1 % FA v ACN) během 80 min, 0,2 mL/min
• Orbitrap Fusion Tribrid MS: režimy DDA HCD, cílené MS2 ETD a MS2 ETD–MS3 HCD
• Software: Thermo Scientific BioPharma Finder

Hlavní výsledky a diskuse

Ve CDR3 doméně Etanerceptu byly potvrzeny následující disulfidické vazby:

• Cys104–Cys112
• Cys112–Cys115 (detekce volného Cys115 po NEM modifikaci)
• Cys121–Cys139

Fragmentační technika ETD prokazuje preferenční štěpení S–S vazeb, generuje c a z fragmenty, a dosahuje strukturální rozlišení blízké hodnotě 1, čímž nepotvrzené vazby jednoznačně potvrzuje. U komplexních vazeb byla použita kaskáda ETD MS2 a následné MS3 HCD pro izolaci jednotlivých peptidů a bohatou sekvenční informaci.
Byla také odhalena variabilita N-terminálního konce: truncated proteoforma AQVAFTPYAPEPGSTC18R s O-core1 modifikací, vedoucí ke zmapování vazeb C18–C31/C32–C45.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje vysoce citlivou UHPLC separaci s pokročilou MSn analýzou:

• Jednoznačná identifikace i složitých disulfidických vzorů
• Odhalení volných cysteinů a nečekaných proteoform
• Vhodné pro vývoj, validaci a kontrolu kvality bioterapeutik

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace vysoce výkonných softwarových nástrojů pro automatickou detekci disulfidů
• Automatizovaná kaskádní MSn analýza pro rychlejší rutinní QC
• Rozšíření na další třídy proteinu a glykoproteiny
• Využití umělé inteligence pro předpověď a validaci disulfidické konektivity

Závěr

Studie demonstruje, že kombinace ETD a MS3 HCD na Orbitrap Fusion Tribrid spolu s blokací volných cysteinů NEM je robustní přístup pro detailní mapování disulfidických vazeb v bioterapeutických proteinech. Metoda odhaluje heterogenitu vazeb a neočekávané proteoformy a je vhodná pro vývoj i rutiní kontrolu kvality.

Reference

Thermo Fisher Scientific. BioPharma Finder Software; Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer Application Note.