Development of accelerate quantification analysis for hydrophilic metabolites using ionparing chromatography with a high-speed triple quadrupole mass spectrometer

Význam tématu

Metabolomika poskytuje komplexní pohled na množství metabolitů v buňkách či organismech. Analýza hydrofilních metabolitů, mezi které patří cukerné fosfáty, organické kyseliny a nukleotidy, je klíčová pro pochopení centrálních energetických drah a jejich regulace. Vysoká rychlost a kvantitativní schopnosti měření jsou nezbytné pro zefektivnění studií s velkým počtem vzorků a pro dynamické sledování metabolických změn.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout zrychlenou kvantitativní metodu pro hydrofilní metabolity pomocí iontově-párové chromatografie (IPC) spojené s vysokorychlostním triple kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem. Autoři porovnali různé chromatografické kolony a optimalizovali chromatografické podmínky i parametry ionizace za účelem dosažení analýzy až 96 analytů během 15 minut.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Shimadzu Nexera
• Chromatografická kolona: L-Column ODSII (2 mm × 150 mm, 3 µm)
• Mobilní fáze: A) 10 mM tri-butylammonium/15 mM kyselina octová (H2O/MeOH 97/3), B) methanol
• Gradient: 0–0,5 min 0 % B, 7,5 min 25 % B, 11–11,5 min 90 % B, 15 min návrat na 0 % B
• Průtok: 0,3 mL/min, teplota kolony 40 °C, injekční objem 3 µL
• MS detektor: Shimadzu LCMS-8040, ESI v negativním módu, teploty DL 250 °C, HB 400 °C, suchý plyn 10 L/min, nebulizační plyn 2 L/min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila separaci a kvantifikaci 96 hydrofilních metabolitů včetně cukerných fosfátů, organických kyselin, nukleotidů a koenzymů v čase kratším než 15 minut. Optimální volbou kolony L-Column ODS se dosáhlo vyhovujících limitů detekce (v rozmezí sub-nanomolárních až mikromolárních) a lineárního rozsahu přes 4 řády. Reprodukibilita retence i špičkových ploch dosahovala RSD nižší než 15 % (častěji pod 5 %). Testovací model z extraktu kvasinek potvrdil detekci 75 složek v koncentracích od 0,4 do 100 000 nM a lineární odezvu analytické odezvy na ředění.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená propustnost analýz: 96 metabolitů za 15 minut
• Vysoká citlivost a široký lineární rozsah umožňují kvantitativní sledování metabolických změn
• Metoda vhodná pro metabolomické studie bakteriálních, kvasinkových a vyšších organismů
• Možnost nasazení v QA/QC laboratořích, farmaceutickém výzkumu a klinických aplikacích

Budoucí trendy a možnosti využití

S integrací automatizace vzorkování a pokročilých datových analýz lze dále zvýšit propustnost a informační hodnotu výsledků. Kombinace IPC-MS/MS s technikami na úrovni lipidomiky a proteomiky umožní komplexní multi-omické studie. Dále je perspektivní vývoj nano- a microflow verzí metodiky pro snížení spotřeby vzorku a zvýšení citlivosti.

Závěr

Studie představuje robustní a rychlou platformu pro kvantifikaci širokého spektra hydrofilních metabolitů. Vyvinutá IPC-MS/MS metoda na LCMS-8040 významně zrychluje analýzu a splňuje nároky na citlivost, linearitu a reprodukovatelnost, což ji činí vhodnou pro metabolomické aplikace.