Ústav analýzy potravin a výživy se věnuje zejména výzkumu chemické bezpečnosti potravin a kvalitě a autenticitě potravin (odhalování falšování potravin).
<h3>Vědecké skupiny</h3>
<ul>
<li><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/vedecke-skupiny/organicke-kontaminanty-v-potravinach-zivotnim-prostredi-a-biomonitoring">Organické kontaminanty v potravinách, životním prostředí a biomonitoring</a></li>
<li><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/vedecke-skupiny/skupina-chemie-potravin-a-prvkove-analyzy">Skupina chemie potravin a prvkové analýzy</a></li>
<li><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/vedecke-skupiny/skupina-vyzivy-a-senzoricke-analyzy">Výživa a senzorická analýza</a></li>
<li><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/vedecke-skupiny/bioaktivni-sekundarni-metabolity">Bioaktivní sekundární metabolity rostlin a mikroorganismů</a></li>
<li><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/vedecke-skupiny/biologicky-aktivni-a-pridatne-latky">Biologicky aktivní a přídatné látky</a></li>
<li><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/vedecke-skupiny/metabolomika-biologickych-systemu">Metabolomika biologických systémů</a></li>
</ul>
<h3><a href="https://uapv.vscht.cz/veda-a-vyzkum/22026/22130">Přístrojové vybavení LC-MS</a></h3>
<ul>
<li>Kapalinové chromatografy s hmotnostními detektory typu LC/Orbitrap, LC/Q-TOF, Iontová mobilita. SFC/Q-TOF, TripleTOF</li>
</ul>
<h4>U-HPLC‒HRMS (<a href="https://lcms.cz/products?search=acquity+&amp;category=37">Acquity UPLC</a> – <a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=3&amp;search=Exactive">Exactive</a>)</h4>
Spojení ultra-účinného kapalinového chromatografu Acquity UPLC (Waters) s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem Exactive (Thermo Scientific) s analyzátorem elektrostatickou orbitální pastí (orbitrap) je vybaven mimo široce rozšířené ambientní ionizace elektrosprejem (ESI) též chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI) i přímé analýzy v reálném čase (DART) bez chromatografické separace.
Přístroj bývá využíván v celo-spektrálním akvizičním módu pro kvantitativní analýzu alkaloidů máku, esterů MCPD a kanabinoidů a necílovou analýzu pro autentikační účely. Bývá též využíván při laboratorní výuce.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_U_HPLC_HRMS_Acquity_UPLC_Exactive_6364151e4e/VSCHT-UAPV-U-HPLCHRMS-(Acquity-UPLC-Exactive).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: U-HPLC‒HRMS (Acquity UPLC – Exactive)"/>
<h4>U-HPLC‒HRMS/MS (<a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=3&amp;search=UltiMate+3000">UltiMate 3000</a> – <a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=3&amp;search=Q-Exactive+Plus">Q-Exactive Plus</a>)</h4>
Moderní technologie přístroje kombinující ultra-účinný kapalinový chromatograf UltiMate 3000 (Thermo Scientific) a vysokorozlišovací tandemový hmotnostní spektrometr Q-Exactive Plus (Thermo Scientific) s analyzátory kvadrupólem a elektrostatickou orbitální pastí (Q-orbitrap) s charakteristickou unikátní přesností hmoty (m/z) umožňuje sběr celo-spektrálních dat a/nebo selekci prekurzorových iontů a fragmentaci. Je možné využití ionizace elektrosprejem (ESI) i chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI).
Přístroj bývá využíván pro kvantitativní a kvalitativní stanovení kanabinoidů, mykotoxinů, toxických rostlinných alkaloidů i reziduí pesticidů, dále nachází využití též v autentikačních studiích zaměřených na hodnotné komodity (víno, olivový olej, ap.).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_U_HPLC_HRMS_MS_Ulti_Mate_3000_Q_Exactive_Plus_b2a9e3eac5/VSCHT-UAPV-U-HPLCHRMS-MS-(UltiMate-3000-Q-Exactive-Plus).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: U-HPLC‒HRMS/MS (UltiMate 3000 – Q-Exactive Plus)"/>
<h4>Agilent <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=32-31-30-29&amp;mainauthorItems=10&amp;search=6560">6560 Ion Mobility Q-TOF LC/MS</a> (Agilent Technologies)</h4>
Kapalinový chromatograf <a href="https://lcms.cz/products/154">Agilent 1290 Infinity II</a> ve spojení s hybridním vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem typu Q-TOF s iontovou mobilitou typu DTIM a detektorem diodového pole (Agilent 6560)
Tento instrumentální systém kombinuje výhody vysokoúčinné kapalinové chromatografie, vysokorozlišovací tandemové hmotnostní spektrometrie s analyzátorem doby letu a kvadrupólem (Q-TOF) a iontové mobility v driftové trubici (DTIM), a umožňuje tak provádět vysoce efektivní trojdimenzionální separaci iontů.
Hmotnostní spektrometr je vybaven iontovým zdrojem <a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=10&amp;search=Jet+Stream">Agilent Jet Stream</a> (AJS), který poskytuje výrazně vyšší citlivost v porovnání s tradičním elektrosprejem. Instrumentace má široký aplikační potenciál pro cílovou i necílovou analýzu komplexních matric.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_Agilent_6560_Ion_Mobility_Q_TOF_LC_MS_Agilent_Technologies_0e5f1fbb2c/VSCHT-UAPV-Agilent-6560-Ion-Mobility-Q-TOF-LC-MS-(Agilent-Technologies).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies)"/>
<blockquote>
<h4>Hlavní výhody systému Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF LC/MS</h4>
</blockquote>
<blockquote>
<ul>
<li>Rozlišení strukturních izomerů - separace izobarických látek v iontové mobilitě umožňuje snadné zkoumání jejich struktury a konformace; současně umožňuje bez referenčních standardů nebo kalibrační křivky přímo měřit hodnoty collision cross section, poskytující informaci o velikosti analyzovaných molekul</li>
<li>Zvýšení kapacity píků - efektivním rozdělením jednotlivých látek v komplexních matricích díky kombinaci UHPLC, iontové mobility a hmotnostní detekce s vysokým rozlišením a přesnou hmotou</li>
<li>Identifikace a konfirmace minoritních složek - díky možnosti odseparování chemického pozadí v iontové mobilitě a vysoké citlivosti dosažené iontovou optikou, což je ideální např. pro detekci malých množství kontaminantů v komplexních matricích; detekce v All Ions MS/MS módu pak umožňuje jednoznačnou identifikaci analytů</li>
<li>Studium nativní struktury proteinů – jednoduché studium struktury proteinů a peptidů v plynné fázi; minimalizací energie iontů je dosahováno zachování nativní struktury i u labilních proteinů</li>
</ul>
</blockquote>
<blockquote>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_Hlavni_vyhody_systemu_Agilent_6560_Ion_Mobility_Q_TOF_LC_MS_8c337585ba/VSCHT-UAPV-Hlavni-vyhody-systemu-Agilent-6560-Ion-Mobility-Q-TOF-LC-MS.jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: Hlavní výhody systému Agilent 6560 Ion Mobility Q-TOF LC/MS"/>
</blockquote>
<blockquote>
Kromě výše zmíněného je systém navíc vybaven přídatným nedestruktivním detektorem diodového pole a umožňuje tak provádění analýz v zapojení LC-DAD-(IM)-Q-TOF.
</blockquote>
Na Ústavu analýzy potravin a výživy VŠCHT Praha je tento instrumentální systém široce využíván především pro analýzy v rámci tzv. ‘omics’ disciplín (metabolomika, lipidomika) a pro separaci izomerních látek, které nelze separovat samotnými chromatografickými technikami.
Mezi konkrétní probíhající studie patří například analýza lipidomu v lidské krevní plasmě, analýza metabolitů pesticidů, metabolomické profilování bioaktivních látek konopí, či studium izomerních forem mykotoxinů a různých bioaktivních látek (např. silymarinu).
<h4>AutoPure <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=47&amp;mainauthorItems=5">prep LC</a> – LCT Premier XE (Waters)</h4>
Preparativní kapalinový chromatograf Waters AutoPurification System ve spojení s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem Waters LCT Premier XE
Preparativní chromatografie je využívána pro přečištění a izolaci biologicky aktivních sloučenin (či skupin sloučenin) z extraktů různých matric za účelem jejich dalšího studia.
<h5>Chromatografický systém disponuje:</h5>
<ul>
<li>(i) kvarterním gradientovým čerpadlem (Waters 2545 Quarternary Gradient Module)</li>
<li>(ii) fluidním organizérem (SFO) umožňujícím automatické přepínání mezi analytickým a preparativním módem separace při zapojení až tří analytických a dvou preparativních kolon</li>
<li>(iii) děličem toku (Flow Splitter; 8-30 ml; 1000:1)</li>
<li>(iv) 515 make-up pumpou</li>
<li>(v) injektorem vzorků/kolektorem frakcí (Waters 2767 Sample Manager) pro práci v analytickém / preparativním režimu, s oddělenými fluidními cestami pro nástřik a sběr frakcí vzorku</li>
</ul>
Díky propojení s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem s analyzátorem TOF (Waters LCT Premier XE) je umožněno provádět sběr frakcí nejen v závislosti na elučním čase analytů, ale zejména selektivně na základě definované přesné hmoty (m/z) iontů zájmových sloučenin.
Pro ionizaci analytů je k dispozici technika elektrospreje. Díky své robustnosti a flexibilní konfiguraci je systém vhodný pro přečištění materiálu v řádech miligramů až několika gramů při zachování vysoké čistoty a výtěžnosti izolovaných sloučenin.
Na Ústavu analýzy potravin a výživy VŠCHT Praha je tento instrumentální systém využíván například pro izolaci glykosylovaných mykotoxinů, či pro frakcionaci extraktů různých rostlinných surovin za účelem chemické charakterizace a dalšího studia biologických aktivit jednotlivých získaných frakcí.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_Auto_Pure_prep_LC_LCT_Premier_XE_Waters_a96a512cca/VSCHT-UAPV-AutoPure-prep-LC-LCT-Premier-XE-(Waters).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: AutoPure prep LC – LCT Premier XE (Waters)"/>
<h4>Kapalinový chromatograf <a href="https://lcms.cz/products?search=acquity+&amp;category=37">Acquity UPLC</a> ve spojení s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31-32-30-29&amp;mainauthorItems=5&amp;search=synapt+g2">Synapt G2</a> (LC-HRMS)</h4>
Spojení ultra-účinné kapalinové chromatografie s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií představuje unikátní nástroj využívaný zejména pro metabolomické studie. Získání charakteristických metabolomických fingerprintů umožňuje kontrolovat kvalitu potravin, ověřovat autenticitu potravin a klasifikovat analyzované vzorky dle zvolených parametrů.
Hmotnostní spektrometr, díky své konstrukci, umožňuje provádět různé experimenty. Lze měřit záznamy v režimu MS1 i MS/MS a v neposlední řadě lze využít i dodatečné separace iontů pomocí iontové mobility. Přístroj umožňuje jak využít ionizace analytů za podmínek elektrospreje tak i chemické ionizace za atmosférického tlaku.
Tato instrumentace je vhodná pro analýzu širokého spektra látek přítomných ve vyšetřovaných vzorcích, uplatňuje se především necílová analýza, avšak i aplikace pro cílovou analýzu vybraných látek je v portfoliu tohoto přístroje.
<h5>Příklady aplikací</h5>
<ul>
<li>Metabolomické studie zaměřené na autentikaci (potvrzení pravosti) potravin rostlinného i živočišného původu</li>
<li>Metabolomický fingerprinting za účelem klasifikace vzorků například dle zeměpisného původu – ověření deklarace geografického původu potraviny.</li>
<li>Průkaz přítomnosti organických nanočástic v ovocných džusech.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_Kapalinovy_chromatograf_Acquity_UPLC_ve_spojeni_s_vysokorozlisovacim_hmotnostnim_spektrometrem_Synapt_G2_LC_HRMS_1eb36e8a73/VSCHT-UAPV-Kapalinovy-chromatograf-Acquity-UPLC-ve-spojeni-s-vysokorozlisovacim-hmotnostnim-spektrometrem-Synapt-G2-(LC-HRMS).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: Kapalinový chromatograf Acquity UPLC ve spojení s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem Synapt G2 (LC-HRMS)"/>
<h4>Superkritický fluidní chromatograf <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=38&amp;mainauthorItems=5&amp;search=UPC2">Aquity UPC2</a> ve spojení s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem <a href="https://lcms.cz/library?instrumentationItems=31-32-30-29-21&amp;mainauthorItems=5&amp;search=synapt+g2+Si">Synapt G2 Si</a> (SFC-HRMS)</h4>
Superkritická fluidní chromatografie je separační technika, která se před několika lety dostala znovu do popředí moderní analytické chemie. Díky použití superkritické tekutiny, oxidu uhličitého, skýtá mnoho nesporných výhod. Oxid uhličitý představuje nepolární mobilní fázi, proto je tato chromatografická technika předurčena především pro analýzu nepolárních složek vzorku. Díky možnosti použití polárních modifikátorů mobilní fáze je rozšířen aplikační potenciál této techniky i o možnost analýzy středně polárních látek.
Pro detekci separovaných látek je využit vysokorozlišovací hmotnostní spektrometr s mnoha různými měřícími funkcemi (MS1, MS/MS, iontová mobilita), což opět umožňuje provést řadu vědeckých experimentů. K přístroji je připojen i konvenční detektor diodového pole. Je tedy možné provádět měření pouze s tímto detektorem, či pouze s MS detektorem či, díky sériovému zapojení, využívat pro detekci oba detektory.
<h5>Příklady aplikací</h5>
<ul>
<li>Metabolomické - lipidomické studie zaměřené na komplexní vyšetření analyzovaných vzorků potravin rostlinného i živočišného původu.</li>
<li>Lipidomický fingerprinting za účelem kontroly kvality potravinových produktů – oleje, čokoláda a jiné.</li>
<li>Komplexní lipidomické vyšetření vzorků lidské plazmy.</li>
<li>Cílová analýza přírodních biologicky aktivních látek – kanabinoidy v konopí, konopných semenech, konopném oleji a dalších výrobcích z konopí.</li>
<li>Analýza kontaminantů zejména v matricích s vyšším obsahem tuku – stanovení aflatoxinů v oříšcích a dalších produktech.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_Superkriticky_fluidni_chromatograf_Aquity_UPC_2_ve_spojeni_s_vysokorozlisovacim_hmotnostnim_spektrometrem_Synapt_G2_Si_SFC_HRMS_34134286cb/VSCHT-UAPV-Superkriticky-fluidni-chromatograf-Aquity-UPC2-ve-spojeni-s-vysokorozlisovacim-hmotnostnim-spektrometrem-Synapt-G2-Si-(SFC-HRMS).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: Superkritický fluidní chromatograf Aquity UPC2 ve spojení s vysokorozlišovacím hmotnostním spektrometrem Synapt G2 Si (SFC-HRMS)"/>
<h4>Kapalinový chromatograf <a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=3&amp;search=UltiMate+3000">U-HPLC Dionex UltiMate 3000</a> ve spojení s vysokorozlišovacím tandemovým hmotnostně spektrometrickým detektorem <a href="https://lcms.cz/library?mainauthorItems=55&amp;search=6600">TripleTOF 6600</a> (LC-HRMS)</h4>
Tento přístroj využívá technologii kvadrupól-Time-of-Flight (Q-TOF) umožňuje měření při vysokém rozlišení a přesné hmotě. Současně je možná selekce prekursorového iontu v kvadrupólu a získání MS-MS spekter, čímž je získána vyšší selektivita a také konfirmace identity analytů porovnáním s MS-MS knihovnami.
Pro ionizaci látek jsou k dispozici techniky elektrosprej a chemická ionizace za atmosférického tlaku. K dispozici je také diferenciální ion mobility technologie SelexIon. K přístroji je dále možno sériově zapojit i konvenční detektor diodového pole.
Přístroj je především využíván pro necílové analýzy v rámci metabolomiky a identifikaci a konfirmaci přítomných látek i pro účely cílového hledání látek a potvrzení jejich přítomnosti v analyzovaných vzorcích.
<h5>Příklady aplikací</h5>
<ul>
<li>Necílová analýza za účelem autentikace potravin a odhalování falšování.</li>
<li>Metabolomické studie za účelem klasifikace vzorků dle zkoumaných parametrů (geografický původ; vliv pěstování, sklizně, technologické úpravy, ošetření vzorků; odrůda atd).</li>
<li>Multiresiduální analýza pesticidů a mykotoxinů v potravinách.</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/VSCHT_UAPV_Kapalinovy_chromatograf_U_HPLC_Dionex_Ulti_Mate_3000_ve_spojeni_s_vysokorozlisovacim_tandemovym_hmotnostne_spektrometrickym_detektorem_Triple_TOFTM_6600_LC_HRMS_a0ae8b3eb5/VSCHT-UAPV-Kapalinovy-chromatograf-U-HPLC-DionexUltiMate-3000-ve-spojeni-s-vysokorozlisovacim-tandemovym-hmotnostne-spektrometrickym-detektorem-TripleTOFTM-6600-(LC-HRMS).jpg" alt="VŠCHT/ÚAPV: Kapalinový chromatograf U-HPLC Dionex UltiMate 3000 ve spojení s vysokorozlišovacím tandemovým hmotnostně spektrometrickým detektorem TripleTOFTM 6600 (LC-HRMS)"/>

VŠCHT ÚAPV: UHPLC/UPLC s HRMS hmotnostními detektory

<h3>Diferenciální diagnostika neuroendokrinních tumorů</h3>
Plazmatické metanefriny, metanefrin a normetanefrin, jsou 3-O-methylované metabolity katecholaminů, které zaujímají důležité místo v diferenciální diagnostice neuroendokrinních onemocnění. Neuroendokrinní nádory představují různorodou skupinu onemocnění s různou klinickou symptomatologií a etiopatogenezí a jejich včasná diagnostika je zcela zásadní pro léčbu a chirurgickou intervenci. Postup při diagnóze neuroendokrinních nádorů je založen na několika aspektech - na klinické symptomatologii, na laboratorní diagnostice a na zobrazovacích technikách.
Neuroendokrinní nádory, které pocházejí z chromafinní tkáně sympatického nebo parasympatického nervového systému, jako jsou feochromocytom nebo paragangliom, vykazují setrvalou nebo paroxyzmální nadměrnou produkci katecholaminů. Laboratorní průkaz nadprodukce katecholaminů tumorem je limitován řadou faktorů jako např. nespecifické zvýšení hodnot v důsledku sekundárního stresování při odběru, nedodržením dietního opatření či zkreslením výsledků přítomností němých feochromocytomů.
Důležitým aspektem pro laboratorní diagnostiku je plynulá a nezávislá produkce metanefrinů nádorovými buňkami. Metanefrin a normetanefrin jsou preferovány pro diferenciální diagnostiku feochromocytomu vzhledem k jejich vysoké diagnostické senzitivitě a specificitě.
V laboratorní diagnostice je pro stanovení volných plazmatických metanefrinů využíváno několik metod. Často se používají metody klasické kapalinové chromatografie s následnou spektrofotometrickou, fluorimetrickou či elektrochemickou detekcí. Tyto metody však vyžadují poměrně náročnou přípravu vzorku a delší chromatografii pro separaci interferujících látek. U metod využívajících plynovou chromatografi i je zase nutná derivatizace analytů pro převedení na jejich těkavou formu. Imunoanalytické metody pro stanovení plazmatických metanefrinů jsou sice jednoduché a rychlé, ovšem jejich výsledky mohou být ovlivněny křížovými reakcemi s dalšími látkami.
<h3>Co nás vedlo k vyvinutí LC-MS/MS metody pro stanovení volných metanefrinů v plazmě?</h3>
V diagnostické laboratoři Spadia a.s. jsme využívali pro kvantitativní stanovení plazmatických metanefrinů IVD kit (in vitro diagnostický kit) na principu ELISA. Později se na trhu objevil IVD kit určený pro HPLC systémy s coulometrickou detekcí, který však vyžadoval poměrně složitou implementaci do rutinního provozu. Proto jsme se rozhodli porovnat ELISA a HPLC metodiky pro stanovení plazmatických metanefrinů pro potřeby privátní laboratoře. Testování odhalilo významné rozdíly v kvantitativních výsledcích obou metod (viz Obrázek 1).
Toto zjištění nás vedlo k rozhodnutí zavést metodu založenou na chromatografickém přístupu. Omezením klasické HPLC metody je ovšem náročná příprava vzorků a dlouhý čas analýzy. Příprava série vzorků pro stanovení HPLC trvá okolo 2 hodin, vyžaduje krok extrakce na tuhou fázi (SPE), odpařování elučního činidla a i samotná analýza je časově velmi náročná (doba analýzy jednoho vzorku trvá okolo 50 minut). Nabízelo se však využití LC-MS/MS techniky, která díky vysoké selektivitě a citlivosti umožňuje přípravu vzorku značně zjednodušit a dobu analýzy výrazně zkrátit.
Cílem této práce byl vývoj a implementace rutinní metody stanovení volných metanefrinů v plazmě, která by eliminovala nevýhody klasických chromatografických technik i dříve využívané ELISA metody.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Obrazek_1_Graficke_znazorneni_koncentraci_normetanefrinu_graf_vlevo_a_metanefrinu_graf_vpravo_v_plazme_HPLC_a_ELISA_ca4068cd37.jpg" alt="SPADIA LAB: Obrázek 1 - Grafické znázornění koncentrací normetanefrinu (graf vlevo) a metanefrinu (graf vpravo) v plazmě stanovených pomocí IVD kitu pro HPLC s elektrochememickou detekcí a IVD kitu využívajícího ELISA (n = 11)"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Obrazek_2_Graficke_znazorneni_koncentraci_normetanefrinu_graf_vlevo_a_metanefrinu_graf_vpravo_v_plazme_HPLC_a_LC_MS_MS_1ad52ad28c.jpg" alt="SPADIA LAB: Obrázek 2 - Grafické znázornění koncentrací normetanefrinu (graf vlevo) a metanefrinu (graf vpravo) v plazmě stanovených pomocí IVD kitu pro HPLC s elektrochememickou detekcí a vyvinuté LC-MS/MS metody (n = 24)"/>
<h3>Vývoj a implementace LC-MS/MS metody pro stanovení volných metanefrinů v plazmě</h3>
<h5>Příprava vzorků</h5>
Vyšetření se provádí ze vzorku plazmy odebrané do odběrové soupravy s antikoagulačním činidlem EDTA. Po odběru je nutné krev centrifugovat 10 min při 4000 g a získanou plazmu do okamžiku provedení analýzy uchovávat při -20 °C.
Příprava vzorku k analýze je nenáročná a nevyžaduje extrakci na pevné fázi (SPE). Ke vzorku jsou přidány deuterované standardy obou analytů, poté je provedena precipitace proteinů isopropanolem, odpaření pod proudem dusíku a rekonstituce ve 100 μl mobilní fáze.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Vyvoj_a_implementace_LC_MS_MS_metody_pro_stanoveni_volnych_metanefrinu_v_plazme_fea8e5e192.jpg" alt="SPADIA LAB: Vývoj a implementace LC-MS/MS metody pro stanovení volných metanefrinů v plazmě"/>
<h5>LC-MS/MS metoda</h5>
Separace plazmatických metanefrinů probíhá na UHPLC systému Agilent 1290 Infinity, na koloně SeQuant®ZIC®HILIC HPLC 3,5 μm; 100 × 2,1 mm (Merck, Německo) a analyty jsou separovány gradientovou elucí mobilních fází skládající se z 50 mM vodného roztoku mravenčanu amonného a acetonitrilu při průtoku 0,3 ml/min a teplotě 45 °C. Analyty jsou detekovány na hmotnostním spektrometru Agilent 6490 Triple Quadrupole (parametry iontového zdroje a MRM přechody jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2). Celková doba analýzy je 6 min a retenční časy separovaných analytů jsou 2,4 min pro MN a 2,6 min pro NMN (Obrázek 3a, 3b).
<h5>Tabulka 1: Parametry LC-MS/MS iontového zdroje</h5>
<ul>
<li>Agilent Jet Stream ESI: pozitivní mód</li>
<li>Teplota sušícího plynu: 135 °C</li>
<li>Průtok sušícího plynu: 12 l/min</li>
<li>Nebulizer: 45 psi</li>
<li>Teplota fokusačního plynu: 400 °C</li>
<li>Průtok fokusačního plynu: 10 l/min</li>
<li>Napětí ESI: 4000 V</li>
<li>Napětí trysky (Nozzle): 0 V</li>
</ul>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Tabulka_2_Tabulka_MRM_prechodu_7a9f81645e.jpg" alt="SPADIA LAB: Tabulka 2 - Tabulka MRM přechodů"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Obrazek_3a_Stanoveni_volnych_metanefrinu_v_plazme_pomoci_LC_MS_MS_metody_chromatogram_kontrolniho_vzorku_bf7a3a5cd1.jpg" alt="SPADIA LAB: Obrázek 3a - Stanovení volných metanefrinů v plazmě pomocí LC-MS/MS metody, chromatogram kontrolního vzorku"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Obrazek_3b_Stanoveni_volnych_metanefrinu_v_plazme_pomoci_LC_MS_MS_metody_chromatogram_pacientskeho_vzorku_0e591172f6.jpg" alt="SPADIA LAB: Obrázek 3b - Stanovení volných metanefrinů v plazmě pomocí LC-MS/MS metody, chromatogram pacientského vzorku"/>
<h5>Porovnání vyvinuté LC-MS/MS metody s kitem pro HPLC</h5>
Vyvinutá metoda byla testována na pacientských vzorcích a data byla porovnána s daty získanými z kitu pro HPLC. Z Obrázku 2 je patrné, že LC-MS/MS metoda poskytovala obdobné výsledky jako HPLC metoda s coulometrickou detekcí. Z pohledu náročnosti na přípravu vzorků a délky chromatografické separace však představuje LC-MS/MS metoda významnou úsporu času a nákladů na analýzu.
Rozsah kalibrace vyvinuté metody pro metanefrin je 0,035 – 7,175 nmol/l (Obrázek 4) s limitem kvantifikace 0,035 nmol/l (CV = 4,8 %) a rozsah kalibrace pro normetanefrin je 0,049 – 9,956 nmol/l (Obrázek 5) s limitem kvantifikace 0,049 nmol/l (CV = 6,7 %). Výtěžnost, určená metodou standardního přídavku se pohybovala v rozmezí 89 – 98 %. Variační koeficienty (CV) preciznosti v sérii a mezilehlé preciznosti se pohybovaly pod 10 % (viz Tabulka 3). 
Pro určení mezilehlé preciznosti byly použity dvě hladiny kontrolních materiálů ClinChek® for Metanephrines.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Tabulka_3_Preciznost_v_serii_a_mezilehla_preciznost_e9b22d853a.jpg" alt="SPADIA LAB: Tabulka 3 - Preciznost v sérii a mezilehlá preciznost"/>
<h3>Závěrem</h3>
Prezentovaná LC-MS/MS metoda poskytuje vyhovující analytické parametry pro oba analyty. Srovnání výsledků s HPLC metodou potvrdilo vhodnost použití tohoto postupu pro stanovení volných metanefrinů v plazmě v rutinní diagnostické laboratoři. Zavedením LC-MS/MS metody do rutinního provozu laboratoře byla významně zjednodušena příprava vzorku a zkrácen čas analýzy z 50 min na 6 min.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Obrazek_4_Kalibracni_krivka_pro_metanefrin_v_plazme_75503363fc.jpg" alt="SPADIA LAB: Obrázek 4 - Kalibrační křivka pro metanefrin v plazmě"/>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/SPADIA_LAB_Obrazek_5_Kalibracni_krivka_pro_normetanefrin_v_plazme_8ae8016471.jpg" alt="SPADIA LAB: Obrázek 5 - Kalibrační křivka pro normetanefrin v plazmě"/>

Stanovení volných plazmatických metanefrinů pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

SPADIA LAB je síť moderních diagnostických laboratoří, která patří k největším poskytovatelům laboratorní medicíny v České republice. Provádíme široké spektrum rutinních, vysoce specializovaných i unikátních vyšetření. Jsme správnou volbou pro všechny lékaře, kteří chtějí poskytovat kvalitní nejen primární zdravotní péči, ale i léčbu ve fakultních nemocnicích. 

SPADIA LAB

je součástí Fakulty potravinářské a biochemické technologie. Výzkumné projekty jsou zaměřeny především na problematiku kvality, autenticity a bezpečnosti potravin, krmiv, potravinových surovin, doplňků stravy apod. 

LCMS novinky se zaměřením na laboratoře - strana 1

Stanovení volných plazmatických metanefrinů pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí

VŠCHT ÚAPV: UHPLC/UPLC s HRMS hmotnostními detektory

Nejbližší akce

LABORATORNÍ MEDICÍNA - ŽERMANICE 2026

Setkání uživatelů Shimadzu 2026

Advances in Chromatography and Electrophoresis & Chiranal 2026

Webináře

Biopharma fundamentals: Fragment analysis by CE

Proteome Discoverer 3.3 SP1: Processing DIA data with DIA-NN node

Improving RNA Purity and Measurement for Reliable Bioprocessing